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谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)試劑盒說明書

時間:2025/1/9閱讀:589
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谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS試劑盒說明書

分光光度法 50 /24 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:

GSEC 6.3.1.2主要存在于植物中,是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一,催化銨離子和谷氨酸合成谷

氨酰胺,不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。

測定原理:

GS ATP Mg2+存在下,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨?;?/span>異羥肟酸,在酸性條件下形成的絡(luò)合物在 540nm 處有最大吸收峰,可用分光光度計測定。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BH6001-50T/24S

Storage

提取液

30ml

4℃

試劑一:液體

12ml

-20℃

試劑二:液體

12ml

-20℃

試劑三:粉劑

2

-20℃

試劑四:液體

15ml

4℃

說明書

1 

試劑一臨用前 37℃預(yù)熱 20min,充分混勻,如有沉淀,靜置 10min,取上清待用。試劑二臨用前 37℃預(yù)熱 20min,充分混勻,如有沉淀,靜置 10min,取上清待用。試劑三用時每瓶加入 5ml 蒸餾水充分溶解待用。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本測定的準備:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104 個):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 540nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在EP 管中加入下列試劑:

試劑名稱μl

測定管

對照管

試劑一

400


試劑二


400

試劑三

175

175

樣本

175

175

混勻,37℃(哺乳動物) 25℃(其他物種)準確水浴 30min

試劑四

250

250

混勻,25℃室溫靜置 10min 后,5000g25℃離心 10min,取上清液測定 540nm 處的吸光值A。A=A

測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

GS 活力單位的計算:

標準曲線:y = 0.8348x + 0.0008,R2 = 0.9999

1、血清(漿)GS 活性

單位定義:每ml 血清(漿)在每ml 反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

計算公式:

GSμmol/h/ml=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷V ÷T=10.268×ΔA

2、組織、細菌或細胞 GS 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/mg prot=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(Cpr×V )÷T

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/g 鮮重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(W× V ÷V 樣總)÷T=10.268×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

單位定義:每 1 萬個細菌或細胞在每ml 反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?;惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

GSμmol/h/104 cell=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(500×V ÷V 樣總)÷T

=0.021×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.75ml V 樣:加入樣本體積,0.175ml;V 樣總:加入提取液體積,1 ml; T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。


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