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氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

時間:2025/1/9閱讀:443
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氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

動物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官,故尿中氨基酸的變化最能反應肝、腎的生理狀態(tài)。另外,氨基酸還能反應灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

測定原理:

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應,產(chǎn)生藍紫色化合物,在 570 nm 有特征吸收峰;通過測定 570 nm

吸光度,來計算氨基酸含量。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BH6012-100T/96S

Storage

試劑一:液體

1

4℃

試劑二:液體

1

4℃

試劑三:粉劑

1

4避光

試劑四:粉劑

1

4避光

標準品:粉劑

1

4避光

說明書

1 

試劑三臨用前加入 667μl 無水乙醇,蓋緊后充分混勻,再加入 9.333ml 蒸餾水混勻,避光保存。試劑四臨用前加 1ml 蒸餾水,充分溶解。

標準品臨用前加 10ml 蒸餾水,充分溶解。1μmol/mL 標準液,4℃避光保存。

 

自備儀器和用品:

臺式離心機、水浴鍋、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

樣品中 AA 提取:

1、按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行室溫勻漿,然后轉(zhuǎn)移到 1.5ml EP 管中,蓋緊后(防止水分散失)置于沸水浴提取 15 min;自來水冷卻后,8000g,,4℃離心 10min,上清液置冰上待測。

2、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104 個):試劑一體積(mL 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細菌

或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);8000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

3、血清等液體:直接檢測。

測定步驟:

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min,調(diào)節(jié)波長到 570 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取EP 管,加入 10μl 蒸餾水,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測定吸光值,記A 空白管。顯色后務必在 30min 內(nèi)測完。

3. 標準管:取EP 管,加入 10μl 標準品,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測定吸光值,記A 標準管。顯色后務必在 30min 內(nèi)測完。

4. 測定管:取EP 管,加入 10μl 上清液,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測定吸光值,記A 測定管。顯色后務必在 30min 內(nèi)測完。

注意:空白管和標準管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按蛋白濃度計算

氨基酸含量μmol /mg prot= [C 標準品×V 標準品×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白)]÷V ×Cpr

=1×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白) ÷Cpr

(2) 按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量(μmol /g 鮮重)=[C 標準品×V 標準品×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白)] ÷V 樣總

÷V ÷W

=1×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白) ÷W

(3) 按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)] ×

V 樣總÷V ×細胞數(shù)量

=1×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷細胞數(shù)量

(4) 按照液體體積計算

氨基酸含量(μmol /mL=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]÷V 

=1×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)

C 標準品:標準品濃度,1 μmol/mL;V 標準品:反應體系中加入標準品體積,0.01ml;W:樣品質(zhì)量, g;V 樣:反應體系中加入樣品提取液體積,0.01ml;V 樣總:樣品提取液總體積,1mL;;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

(1) 按蛋白濃度計算

氨基酸含量μmol /mg prot=[C 標準品×V 標準品×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白)] ÷V ×Cpr


=1×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白) ÷Cpr

(2) 按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量(μmol /g 鮮重)=[C 標準品×V 標準品×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白)]×V 樣總÷V樣)÷W

=1×(A 測定-A 空白)÷(A 標準-A 空白) ÷W

(3) 按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量(μmol /104 cell= [C 標準品×V 標準品×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)] ×

V 樣總÷V ×細胞數(shù)量

=1×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷細胞數(shù)量

(4) 按照液體體積計算

氨基酸含量(μmol /mL=[C 標準品×V 標準品×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)]÷V 

=1×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)

C 標準品:標準品濃度,1 μmol/mL;V 標準品:反應體系中加入標準品體積,0.01ml;W:樣品質(zhì)量, g;V 樣:反應體系中加入樣品提取液體積,0.01mL;V 樣總:樣品提取液總體積,1mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL

注意事項:

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制,且避光保存,配制好未使用完的 4℃保存且 3

天內(nèi)使用完畢。

2. 為保證實驗結(jié)果的準確性,需先取 1-2 個樣做預實驗,如果測定的吸光值過高(高于 2.5),用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應在 570nm 處無吸收峰,因此,570nm 處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4. *低限為 100μmol/L。


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