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脯氨酸脫氫酶( Proline dehydrogenase,ProDH)試劑盒說明書

時間:2025/1/9閱讀:321
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脯氨酸脫氫酶試劑盒說明書

微量法 100 /96 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

ProDH 是存在于線粒體內的催化脯氨酸降解的關鍵酶。脯氨酸是分布*廣泛的一種滲透物質,在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內累積大量脯氨酸,降低 ProDH 活性對于調節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對植物造成傷害、清除自由基、保護細胞結構具有重要意義。

測定原理:

利用異硫氰酸甲酯檢測 ProDH 催化的脫氫反應,600nm 處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

組成:

 

產品名稱

BH6008-100T/96S

Storage

提取液:液體

100ml

4

試劑一:液體

2ml

4

試劑二:液體

25ml

4

試劑三:粉劑

1

4

試劑四:粉劑

1

4

試劑五:粉劑

4

4

說明書

1 

 

試劑三臨用前加入 4ml 蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑 4℃保存;試劑四臨用前加入 4ml 蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑 4℃保存;

自備儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取:

按照組織質量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 樣本,加入 1ml 提取液),進行冰浴勻漿,1500g 4℃離心 15min,取上清液于一支新的 EP 管中,加入一滴試劑一( 10μl 的槍頭加入),渦旋混勻,冰浴放置 30min 后,16000g 4℃離心 20min,取上清置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節(jié)波長至 600nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

(1) 混合液的配制:首先將試劑三和試劑四配成溶液(見試劑的組成和配制),臨用前根據用量按照試劑二(V):試劑三(V):試劑四(V=2.4ml):0.3ml):0.3ml)的比例充分混勻。(注意:現配現用,用多少配多少),置于 30℃水浴 5min;

(2) 試劑五的配制:取試劑五一支,臨用前加入 500μl 蒸餾水充分溶解待用,現配現用。

(3) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 35μl 樣本、15μl 試劑五和 150μl 混合液,混勻,立即記錄

600nm 處初始吸光值A1  10min 后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

ProDH 活性計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每分鐘每 mg 組織蛋白在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDHU/mg prot=ΔA×V 反總÷(V ×Cpr÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位定義:每分鐘每 g 組織在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.01 為一個酶活力單位。

ProDHU/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V ÷V 樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V 反總:反應體系總體積,0.2ml V 樣:加入樣本體積,0.035ml;V 樣總:加入提取液體積,1 ml; T:反應時間,10 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mlW:樣本質量,g

b.  96 孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每分鐘每 mg 組織蛋白在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.005 為一個酶活力單位。

ProDHU/mg prot=ΔA×V 反總÷(V ×Cpr÷0.005÷T =114.29×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位定義:每分鐘每 g 組織在每ml 反應體系中使 600nm 處吸光值變化 0.005 為一個酶活力單位。

ProDHU/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V ÷V 樣總)÷0.005÷T =114.29×ΔA÷W

V 反總:反應體系總體積,0.2mlV 樣:加入樣本體積,0.035ml;V 樣總:加入提取液體積,1 ml; T:反應時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g。


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