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【瑞孚迪干貨放送】HTRF磷酸化檢測注意事項

2024-10-31  閱讀(146)

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細(xì)胞內(nèi)信號通路,也稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián),在感知和整合不同的外部刺激以產(chǎn)生生物反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞過程(增殖、遷移、分化、營養(yǎng)代謝……)。磷酸化反應(yīng)是由激酶介導(dǎo)的翻譯后修飾,控制參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)的活性。因此,它是感興趣途徑激活狀態(tài)的反映。

就磷酸化檢測而言,最佳檢測條件不僅取決于所研究的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及所研究的化合物(激活劑或抑制劑)的藥理學(xué)特征,還取決于用于檢測的特定細(xì)胞模型(貼壁或懸浮細(xì)胞、永生化細(xì)胞系或原代細(xì)胞、腫瘤、組織……)。正確優(yōu)化檢測條件對于確保獲得最佳的試劑使用和性能至關(guān)重要。

本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit為例,為廣大研究者提供優(yōu)化磷酸化蛋白檢測的實用技巧,讓大家更深入地了解如何優(yōu)化過程中的各個步驟以獲得最佳的檢測結(jié)果。


圖1:Process flow for detecting GPCR-mediated ERK1/2 phosphorylation.Optimize preparation of working cells


TIP1:Optimize cell density for the best signal amplitude(優(yōu)化細(xì)胞密度)

HTRF信號與處理產(chǎn)生的磷酸化蛋白和總蛋白的量成正比,信號隨著磷酸化蛋白濃度增加而增加,如果檢測中磷酸化蛋白質(zhì)的量明顯高于孔中存在的檢測抗體的量,則信號會下降(鉤狀效應(yīng))。有必要針對每個HTRF磷酸化或總蛋白檢測試劑盒、不同的細(xì)胞模型、甚至每個實驗條件進(jìn)行細(xì)胞密度優(yōu)化,以避免鉤狀效應(yīng)。


圖2:使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit進(jìn)行不同細(xì)胞密度檢測p-ERK,找到檢測最佳信號窗口的條件。每孔50K細(xì)胞密度會產(chǎn)生鉤狀效應(yīng),而每孔12.5K細(xì)胞密度條件可產(chǎn)生最佳信號。


TIP2:Optimize the presence of serum in the cell culture medium(血清饑餓處理)

根據(jù)要研究的信號通路,細(xì)胞饑餓處理可能有利于減少目標(biāo)蛋白質(zhì)的本底水平。通常情況下,從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除血清是使細(xì)胞饑餓的有效方法,但對于某些細(xì)胞模型來說,血清的存在對于細(xì)胞生長或增殖至關(guān)重要。在這種情況下,可以選擇將血清濃度降低至0.5% 或不高于2%,同時應(yīng)優(yōu)化血清饑餓的時間。


圖3:在此實驗中,2小時血清饑餓步驟(紅色曲線)實現(xiàn)了最佳的p-ERK檢測(S/B和EC50)。


TIP3:Distribute compounds in the presence of cell culture medium(在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下進(jìn)行加藥處理)

在將化合物/藥物分配到細(xì)胞上之前,請勿從微孔板中除去細(xì)胞培養(yǎng)基。加藥步驟中去除培養(yǎng)基會對某些磷酸化蛋白檢測產(chǎn)生不良影響。在去除培養(yǎng)基加藥的情況下,高本底水平基本上掩蓋了任何誘導(dǎo)的藥理學(xué)劑量反應(yīng)的檢測;當(dāng)培養(yǎng)基存在的情況下加藥時,本底水平較低并且可以檢測到劑量反應(yīng)(見圖4)。


圖4:直接加藥或去除培養(yǎng)基后加藥的檢測對比。結(jié)果表明,為了正確檢測劑量反應(yīng),必須在細(xì)胞培養(yǎng)基存在的情況下直接加藥處理。


TIP4:Optimize stimulation time(化合物刺激時間)

評估化合物刺激時間,找出產(chǎn)生最佳信號窗口的時間。


圖5:不同藥物刺激時間后,使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit檢測p-ERK。結(jié)果表明,刺激細(xì)胞時間過短或時間過長都可能會降低信號窗口。


TIP5: Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium(藥物處理結(jié)束后盡快加入lysis buffer

去除刺激介質(zhì)后延遲添加裂解緩沖液可能會影響化合物的劑量反應(yīng)。該實驗中,在去除刺激緩沖液后延遲不同時間后加入裂解液—— 5、10或30分鐘。結(jié)果顯示當(dāng)延遲添加裂解緩沖液時,會對磷酸化ERK的檢測到產(chǎn)生不利影響。


圖6:在裂解步驟之前去除刺激緩沖液后等待時間的影響,去除培養(yǎng)基后必須立即添加裂解緩沖液。


通過上述實用技巧分享希望能夠幫助大家獲得最佳的檢測結(jié)果,磷酸化檢測不僅提供HTRF方案還有Alpha方案,下期再見!


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