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瑞孚迪(Revvity)均相檢測技術助力癌癥免疫治療的雙特異性抗體研究

2024-10-31  閱讀(160)

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在癌癥免疫治療時代,諸如PD-1單抗等的熱門單靶點藥物競爭已呈現(xiàn)狀態(tài),產(chǎn)品同質化嚴重,市場空間被嚴重擠壓,且存在耐藥性風險,以上問題刺激了對具有增強特異性和效力的雙特異性抗體的研究。雙特異性抗體(bsAb)是免疫療法中快速發(fā)展的領域,作為下一代癌癥治療策略備受關注。BsAb是重組分子,旨在同時靶向兩種不同的抗原或表位。這些抗體具有雙重鏈和輕鏈組成的傳統(tǒng) Y 形結構,每個臂都有一個活性位點,可與不同的靶標結合。根據(jù)生物學靶點和作用方式,bsAb分為四大類(如Figure 1):

1Immune effector cell redirectors , 通過與腫瘤相關抗原和免疫細胞受體(例如CD3、CD16或NKG2D)結合橋聯(lián)腫瘤細胞和免疫效應細胞;
2Tumor-targeted immunomodulators,同時與T細胞和腫瘤細胞上的共信號分子(如CD28和4-1BB)結合,誘導激活T細胞的腫瘤特異性;
3Dual immunomodulators, 通過協(xié)同信號傳導途徑的雙重靶向來調(diào)節(jié)兩種不同免疫調(diào)節(jié)途徑的活性;
4通過抑制血管生成、RTK活性或CD47結合來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的功能途徑。





Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.


BsAb作用機制在各種癌癥的臨床前和臨床研究中取得了良好的療效,目前,已有八款癌癥免疫治療bsAbs獲得FDA/EMA 的批準(如Table 1)。






Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.


相比于傳統(tǒng)單抗,bsAb在治療方面更具潛在優(yōu)勢,包括:(1)介導免疫細胞對腫瘤的殺傷;(2)增強對免疫系統(tǒng)的激活作用;(3)雙靶點信號阻斷,防止耐藥;(4)具備更強特異性、靶向性和低脫靶毒性;(5)介導更強的內(nèi)吞作用。


BsAb 的功效、安全性和臨床成功受其特性的影響,包括理化特性(大小、穩(wěn)定性、結合親和力和效價)、藥代動力學 (PK)/藥效學 (PD) 特性、可制造性和免疫原性等,bsAb的全面表征對于其設計和開發(fā)以及評估其功效和安全性至關重要,故需要從多方面并結合一系列技術來全面了解bsAb的特性以及驅動免疫系統(tǒng)靶向癌細胞的能力。在這里,我們介紹幾種均相檢測技術來表征靶向免疫檢查點和腫瘤壞死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。


BsAb表征過程中的細胞因子研究的重要性

……


(1)Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody


Chan等人研究了由抗PD-1抗體與抗GITR-L抗體融合組成的bsAb對免疫細胞活性的影響。作為研究的一部分,研究者進行了PBMC共刺激檢測,以探究bsAb治療對細胞因子釋放的影響——將PBMC鋪板并在抗CD3存在的情況下用不同稀釋度的抗體進行處理。孵育48h和96h后,使用AlphaLISA®試劑盒檢測收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平,并使用具有Alpha模塊的酶標儀對結果進行定量。


結果顯示,與單一治療和1:1聯(lián)合治療相比,bsAb(抗 PD-1–GITR-L)治療可誘導細胞因子的劑量依賴性增加(如Figure 2)。該數(shù)據(jù)不僅提供了關于bsAb如何影響免疫細胞行為的見解,還強調(diào)了與單一療法和聯(lián)合療法的效果相比,抗PD-1-GITR-L雙特異性抗體如何具有不同的作用機制。






Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.






Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology

AlphaLISA是一種基于微珠的均相檢測技術,AlphaLISA細胞因子測定使用兩種針對目標細胞因子的特異性抗體。一種是生物素化的,與鏈霉親和素包被的供體微珠結合,另一種則直接與受體微珠結合。在細胞因子存在的情況下,抗體與細胞因子結合,使供體和受體微珠靠近,當供體微珠激發(fā)后產(chǎn)生單線態(tài)氧進而激發(fā)受體微珠產(chǎn)生特異性信號,生成的AlphaLISA信號與樣品中存在的細胞因子的量成正比關系。


(2)Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody


2021年上海復旦大學張雪梅團隊開發(fā)了一種新型雙特異性抗體HB0025,該抗體同時靶向PD-L1和VEGF。該bsAb是通過將VEGF受體1結構域(VEGFR1D2)與抗PD-L1 mAb融合而形成的。作為研究的一部分,研究人員通過測量細胞因子分泌水平來評估HB0025阻斷PD-1和PD-L1之間相互作用的能力。將PBMC與樹突狀細胞在96孔板中共培養(yǎng),并接受HB0025、atezolizumab(一種PD-L1靶向抗體)、bevacizumab(一種VEGF靶向抗體)、陰性對照 (900543) 的處理。經(jīng)過5天的孵育期后,使用HTRF技術檢測上清液中IL-2的濃度。


結果顯示,HB0025和atezolizumab均以劑量依賴性方式促進IL-2分泌增加,VEGF靶向抗體bevacizumab不會影響IL-2的分泌(如Figure 4)。該數(shù)據(jù)證明了HB0025的抗腫瘤作用,并表明新型雙特異性抗體有效維持了其parent molecular的結合和阻斷能力。






Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.






Figure 5: Principle of the HTRF assay

HTRF是一種基于熒光基團的均相檢測技術,該技術將熒光共振能量轉移 (FRET) 技術與熒光時間分辨測量相結合(如Figure 5)。針對細胞因子檢測,其中一個抗體標記了供體熒光基團,另一個抗體標記了受體熒光基團,當加入待分析物時,如果待分析物同時與兩個抗體都結合,則供體熒光基團和受體熒光基團的距離被拉進,當激發(fā)供體熒光基團后,供體和受體之間產(chǎn)生FRET,進而激發(fā)受體熒光基團產(chǎn)生特異性信號,該信號與待分析物的濃度成正比關系。


BsAb表征過程中的殺傷作用的重要性

……


Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增強基于抗體治療霍奇金淋巴瘤(HRS)的特異性。該BsAb設計用于選擇性結合CD30/CD137雙陽性HRS細胞。為了測試bsAb的殺傷效率,研究者使用DELFIA® EuTDA試劑盒進行了ADCC測定。該項研究中,HRS細胞用DELFIA BATDA試劑標記,并與雙特異性抗體和對照抗體一起接種到96孔板中,然后添加效應細胞(NK細胞)并孵育3h。該測定的讀數(shù)基于使用多功能酶標儀測量的熒光值,測量的信號值與裂解細胞的數(shù)量直接相關。


結果表明,與對照抗體相比,使用兩個bsAb clone進行處理可使雙陽性 (CD30+ CD137+) 細胞的殺傷率增加約4倍(如Figure 6)。此外,與自發(fā)裂解水平相比,這些clone對單陽性細胞的殺傷效率相當。這表明bsAb對雙陽性細胞的選擇特異性,突出了bsAb觸發(fā)針對特定細胞群的ADCC潛力。






Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.

HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.






Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.

DELFIA Eu TDA檢測法是一種非放射性的細胞殺傷檢測方法,具有標記特異性,高靈敏度,可操作性,安全性,穩(wěn)定性等優(yōu)點。如Figure 7,靶細胞與BATDA進行孵育標記,然后與抗體結合,并與免疫效應細胞共培養(yǎng)。抗體與靶細胞表面的抗原結合,而效應細胞與抗體的Fc區(qū)結合,與靶細胞形成復合物。復合物的形成會激活免疫效應細胞,從而對靶細胞進行細胞裂解,細胞裂解后TDA被釋放到上清液中。將上清液轉移至新的檢測板中,并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物,使用兼容時間分辨熒光(TRF)的酶標儀進行讀值(設置檢測信號在340nm處激發(fā),在615nm處發(fā)射)。


小結

雙特異性抗體的成功在于其能夠克服當前免疫療法的局限性,并提高療效和安全性。盡管目前獲批的bsAb產(chǎn)品不多,但隨著血友病領域雙特異性抗體 Emicizumab的成功上市,并在5年間成為年銷售額33億美元的全球重磅藥物,引發(fā)了一波雙特異性抗體研發(fā)熱潮。


瑞孚迪(Revvity)擁有一系列的高通量檢測技術平臺(HTRF,ALPHA,LANCE,DELFIA),同時還提供Toolbox 試劑以及實驗服務,可以滿足您對雙特異性抗體研究的多種需求,助力您獲得結果。



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