聯(lián)系電話
上海瑋馳儀器有限公司
中級會員·6年
- 聯(lián)系人：
- 蘇小姐
- 電話：
- 400-820-3556
- 手機：
- 18521301252
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)環(huán)科路999弄浦東國際人才港13號樓2樓
- 網(wǎng)址：
- www.weichilab.com
掃一掃訪問手機商鋪
在癌癥免疫治療時代，諸如PD-1單抗等的熱門單靶點藥物競爭已呈現(xiàn)狀態(tài)，產(chǎn)品同質化嚴重，市場空間被嚴重擠壓，且存在耐藥性風險，以上問題刺激了對具有增強特異性和效力的雙特異性抗體的研究。雙特異性抗體（bsAb）是免疫療法中快速發(fā)展的領域，作為下一代癌癥治療策略備受關注。BsAb是重組分子，旨在同時靶向兩種不同的抗原或表位。這些抗體具有雙重鏈和輕鏈組成的傳統(tǒng) Y 形結構，每個臂都有一個活性位點，可與不同的靶標結合。根據(jù)生物學靶點和作用方式，bsAb分為四大類（如Figure 1）：
| 1 | Immune effector cell redirectors , 通過與腫瘤相關抗原和免疫細胞受體（例如CD3、CD16或NKG2D）結合橋聯(lián)腫瘤細胞和免疫效應細胞； |
| 2 | Tumor-targeted immunomodulators，同時與T細胞和腫瘤細胞上的共信號分子（如CD28和4-1BB）結合，誘導激活T細胞的腫瘤特異性； |
| 3 | Dual immunomodulators, 通過協(xié)同信號傳導途徑的雙重靶向來調(diào)節(jié)兩種不同免疫調(diào)節(jié)途徑的活性； |
| 4 | 通過抑制血管生成、RTK活性或CD47結合來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的功能途徑。 |
Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.
BsAb作用機制在各種癌癥的臨床前和臨床研究中取得了良好的療效，目前，已有八款癌癥免疫治療bsAbs獲得FDA/EMA 的批準（如Table 1）。
Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.
相比于傳統(tǒng)單抗，bsAb在治療方面更具潛在優(yōu)勢，包括：（1）介導免疫細胞對腫瘤的殺傷；（2）增強對免疫系統(tǒng)的激活作用；（3）雙靶點信號阻斷，防止耐藥；（4）具備更強特異性、靶向性和低脫靶毒性；（5）介導更強的內(nèi)吞作用。
BsAb 的功效、安全性和臨床成功受其特性的影響，包括理化特性（大小、穩(wěn)定性、結合親和力和效價）、藥代動力學 (PK)/藥效學 (PD) 特性、可制造性和免疫原性等，bsAb的全面表征對于其設計和開發(fā)以及評估其功效和安全性至關重要，故需要從多方面并結合一系列技術來全面了解bsAb的特性以及驅動免疫系統(tǒng)靶向癌細胞的能力。在這里，我們介紹幾種均相檢測技術來表征靶向免疫檢查點和腫瘤壞死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。
BsAb表征過程中的細胞因子研究的重要性
……
（1）Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody
Chan等人研究了由抗PD-1抗體與抗GITR-L抗體融合組成的bsAb對免疫細胞活性的影響。作為研究的一部分，研究者進行了PBMC共刺激檢測，以探究bsAb治療對細胞因子釋放的影響——將PBMC鋪板并在抗CD3存在的情況下用不同稀釋度的抗體進行處理。孵育48h和96h后，使用AlphaLISA®試劑盒檢測收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平，并使用具有Alpha模塊的酶標儀對結果進行定量。
結果顯示，與單一治療和1:1聯(lián)合治療相比，bsAb（抗 PD-1–GITR-L）治療可誘導細胞因子的劑量依賴性增加（如Figure 2）。該數(shù)據(jù)不僅提供了關于bsAb如何影響免疫細胞行為的見解，還強調(diào)了與單一療法和聯(lián)合療法的效果相比，抗PD-1-GITR-L雙特異性抗體如何具有不同的作用機制。
Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.
Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology
AlphaLISA是一種基于微珠的均相檢測技術，AlphaLISA細胞因子測定使用兩種針對目標細胞因子的特異性抗體。一種是生物素化的，與鏈霉親和素包被的供體微珠結合，另一種則直接與受體微珠結合。在細胞因子存在的情況下，抗體與細胞因子結合，使供體和受體微珠靠近，當供體微珠激發(fā)后產(chǎn)生單線態(tài)氧進而激發(fā)受體微珠產(chǎn)生特異性信號，生成的AlphaLISA信號與樣品中存在的細胞因子的量成正比關系。
（2）Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody
2021年上海復旦大學張雪梅團隊開發(fā)了一種新型雙特異性抗體HB0025，該抗體同時靶向PD-L1和VEGF。該bsAb是通過將VEGF受體1結構域(VEGFR1D2)與抗PD-L1 mAb融合而形成的。作為研究的一部分，研究人員通過測量細胞因子分泌水平來評估HB0025阻斷PD-1和PD-L1之間相互作用的能力。將PBMC與樹突狀細胞在96孔板中共培養(yǎng)，并接受HB0025、atezolizumab（一種PD-L1靶向抗體）、bevacizumab（一種VEGF靶向抗體）、陰性對照 (900543) 的處理。經(jīng)過5天的孵育期后，使用HTRF技術檢測上清液中IL-2的濃度。
結果顯示，HB0025和atezolizumab均以劑量依賴性方式促進IL-2分泌增加，VEGF靶向抗體bevacizumab不會影響IL-2的分泌（如Figure 4）。該數(shù)據(jù)證明了HB0025的抗腫瘤作用，并表明新型雙特異性抗體有效維持了其parent molecular的結合和阻斷能力。
Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.
Figure 5: Principle of the HTRF assay
HTRF是一種基于熒光基團的均相檢測技術，該技術將熒光共振能量轉移 (FRET) 技術與熒光時間分辨測量相結合（如Figure 5）。針對細胞因子檢測，其中一個抗體標記了供體熒光基團，另一個抗體標記了受體熒光基團，當加入待分析物時，如果待分析物同時與兩個抗體都結合，則供體熒光基團和受體熒光基團的距離被拉進，當激發(fā)供體熒光基團后，供體和受體之間產(chǎn)生FRET，進而激發(fā)受體熒光基團產(chǎn)生特異性信號，該信號與待分析物的濃度成正比關系。
BsAb表征過程中的殺傷作用的重要性
……
Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增強基于抗體治療霍奇金淋巴瘤（HRS）的特異性。該BsAb設計用于選擇性結合CD30/CD137雙陽性HRS細胞。為了測試bsAb的殺傷效率，研究者使用DELFIA® EuTDA試劑盒進行了ADCC測定。該項研究中，HRS細胞用DELFIA BATDA試劑標記，并與雙特異性抗體和對照抗體一起接種到96孔板中，然后添加效應細胞（NK細胞）并孵育3h。該測定的讀數(shù)基于使用多功能酶標儀測量的熒光值，測量的信號值與裂解細胞的數(shù)量直接相關。
結果表明，與對照抗體相比，使用兩個bsAb clone進行處理可使雙陽性 (CD30+ CD137+) 細胞的殺傷率增加約4倍（如Figure 6）。此外，與自發(fā)裂解水平相比，這些clone對單陽性細胞的殺傷效率相當。這表明bsAb對雙陽性細胞的選擇特異性，突出了bsAb觸發(fā)針對特定細胞群的ADCC潛力。
Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.
HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.
Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.
DELFIA Eu TDA檢測法是一種非放射性的細胞殺傷檢測方法，具有標記特異性，高靈敏度，可操作性，安全性，穩(wěn)定性等優(yōu)點。如Figure 7，靶細胞與BATDA進行孵育標記，然后與抗體結合，并與免疫效應細胞共培養(yǎng)。抗體與靶細胞表面的抗原結合，而效應細胞與抗體的Fc區(qū)結合，與靶細胞形成復合物。復合物的形成會激活免疫效應細胞，從而對靶細胞進行細胞裂解，細胞裂解后TDA被釋放到上清液中。將上清液轉移至新的檢測板中，并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物，使用兼容時間分辨熒光（TRF）的酶標儀進行讀值（設置檢測信號在340nm處激發(fā)，在615nm處發(fā)射）。
小結
雙特異性抗體的成功在于其能夠克服當前免疫療法的局限性，并提高療效和安全性。盡管目前獲批的bsAb產(chǎn)品不多，但隨著血友病領域雙特異性抗體 Emicizumab的成功上市，并在5年間成為年銷售額33億美元的全球重磅藥物，引發(fā)了一波雙特異性抗體研發(fā)熱潮。
瑞孚迪（Revvity）擁有一系列的高通量檢測技術平臺（HTRF，ALPHA，LANCE，DELFIA），同時還提供Toolbox 試劑以及實驗服務，可以滿足您對雙特異性抗體研究的多種需求，助力您獲得結果。
