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如何運用HTRF&AlphaLISA實現(xiàn)AAV載體的定量和空殼率計算

2024-10-31  閱讀(167)

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基因治療是指將正常的或者有治療作用的遺傳物質(zhì)引入到患者體內(nèi)使其表達從而達到治療目的。基因治療的關(guān)鍵是有效地將基因輸送到靶組織/細胞,這是通過基因遞送載體來實現(xiàn)的。腺相關(guān)病毒(AAV)載體是目前基因治療中病毒載體之一,因其具有免疫原性低、不整合到宿主基因組、能夠在體內(nèi)提供長期基因表達等優(yōu)點,在基因治療中顯示出巨大的潛力。





AAV是一種單鏈DNA(ssDNA)無包膜病毒,屬于細小病毒家族,直徑約25nm。目前有九種AAV血清型,每一種都有不同的嗜性,包括視網(wǎng)膜、肺、肌肉、肝臟和腦細胞。該病毒只由蛋白質(zhì)和DNA組成,其衣殼由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3以 5:5:50的比例構(gòu)成。





在AAV藥物早期開發(fā)階段,需要在多個工藝步驟中多次對AAV載體進行定量從而不斷優(yōu)化工藝生產(chǎn)高滴度病毒載體。傳統(tǒng)的檢測方法通常耗時多,效率低,自動化程度低。Revvity公司現(xiàn)推出可以定量檢測多種AAV血清型的HTRF和AlphaLISA試劑盒,具有操作簡單,樣本需求量少,線性范圍寬,可實現(xiàn)高通量等優(yōu)勢。產(chǎn)品列表如下:





部分驗證數(shù)據(jù)

HTRF AAV2 capsid detection

檢測范圍:4.35E+09–6.00E+11VP/mL






AlphaLISA AAV2 capsid detection

檢測范圍:4.5E+06–1.0E+11VP/mL






空殼率計算


在AAV載體的制造過程中,會產(chǎn)生三種衣殼,分別是:完整衣殼(full capsid)、部分衣殼(partial capsid)和空衣殼(empty capsid)。其中部分衣殼和空衣殼屬于生產(chǎn)中的雜質(zhì),因此需要在整個生產(chǎn)過程中監(jiān)測空殼率。





在這里,我們介紹一種僅需要分別檢測衣殼和ssDNA的含量即可通過公式計算得到AAV樣品中完整衣殼(full capsid)百分比的新方法。


所需材料

1. 已知full capsid百分比的標準品(可購買商品化標準品)

2. 待測樣品


公式推導(dǎo)




由于partial capsid在純化樣品中的百分比小于1%, 為簡化后續(xù)計算,將它排除在分析之外。

N: number of AAV capsids in the sample

Ns: number of AAV capsids in the standard

f: full

e: empty





Rp: the ratio of the concentration (c) of proteins in the sample and standard

α: each capsid is composed of α μg of total proteins





RDNA: ratio for the concentration of ssDNA in the sample and standard





βs:the standard comes with a known percent of full capsids

通過以上公式換算便可得到樣本中full capsid的比例β





根據(jù)上述公式,我們可以通過運用HTRF或AlphaLISA的AAV定量試劑盒分別檢測樣本和標準品中衣殼數(shù)量,通過比值得到Rp。再通過LabChip、qPCR等其他ssDNA檢測手段分別檢測樣本和標準品中ssDNA的濃度,通過比值得到RDNA。這樣通過引入標準品采用比值法,便可以顯著降低不同檢測方法之間的不匹配度,得到更加準確的結(jié)果。


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