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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國(guó)

收錄于合集 #mRNA 7個(gè)

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崔宇 冉良驥

今天與大家分享一篇由中國(guó)食品藥品檢定研究院（NIFDC）與賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司共同發(fā)表于Vaccines的文章，主要內(nèi)容為基于電霧式檢測(cè)器（CAD）完成了對(duì)于新型冠狀病毒mRNA疫苗中脂質(zhì)體方法學(xué)的建立及驗(yàn)證，并完成了mRNA疫苗中脂質(zhì)體含量的測(cè)定，對(duì)于控制mRNA疫苗的安全性和有效性具有重要意義。

01

背景介紹

2023年6月15日，比爾?蓋茨在全球健康藥物研發(fā)中心舉辦的特別活動(dòng)中表示， mRNA疫苗技術(shù)使預(yù)防結(jié)核病和瘧疾等疾病的疫苗成為可能。與傳統(tǒng)滅活或減毒病毒疫苗、基因工程重組疫苗和基于病毒載體的疫苗等疫苗平臺(tái)相比，mRNA疫苗具有安全性高、表達(dá)瞬間、體液免疫和細(xì)胞免疫雙重機(jī)制、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高、成本低等特點(diǎn)。因此，它們?cè)谔幚泶笠?guī)模和新出現(xiàn)的流行病方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。然而，mRNA疫苗也存在不穩(wěn)定、免疫原性高、遞送效率低等缺點(diǎn)。定制遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)可以進(jìn)一步提高mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染能力。脂質(zhì)納米顆粒是目前這些mRNA疫苗應(yīng)用最廣泛的遞送系統(tǒng)。

一種用于COVID-19 mRNA疫苗遞送的LNPs系統(tǒng)(如下圖1所示)，使用以下四種類型的脂質(zhì)體：具有胺官能團(tuán)的陽(yáng)離子脂質(zhì) (9001)，脂質(zhì)-聚乙二醇2K偶聯(lián)物(DMG-PEG2K)，膽固醇(CHOLE)和兩性離子輔助磷脂(DSPC)。脂質(zhì)體在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中容易聚集和降解，影響了COVID-19 mRNA疫苗的效率和安全性。因此，脂質(zhì)體的含量對(duì)確保COVID-19 mRNA疫苗的質(zhì)量至關(guān)重要，需要在生產(chǎn)和放行階段嚴(yán)格控制。本文建立了一種高效的高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器(HPLC-CAD)方法，用于LNPs包封的COVID-19 mRNA疫苗的脂質(zhì)體分析，并對(duì)該方法進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證。

圖1. LNP遞送系統(tǒng)

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02

材料及方法

儀器配置：

Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 液相色譜儀、Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD檢測(cè)器

色譜條件：

C18色譜柱；流動(dòng)相A：0.01M 乙酸三乙胺水溶液，流動(dòng)相B：0.01M 乙酸三乙胺甲醇；流速為1.0 mL/min；柱溫為55℃；進(jìn)樣體積：10μL

梯度洗脫條件見(jiàn)下表：

電霧式檢測(cè)器：采集頻率10Hz；蒸發(fā)溫度50℃，濾波3.6s

03

結(jié)果與討論

專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)比混標(biāo)溶液、專屬性溶液（不含脂質(zhì)體的mRNA的空白）和純甲醇色譜圖結(jié)果可見(jiàn)，脂質(zhì)體出峰位置沒(méi)有其他干擾峰的存在。

圖2. 50%濃度混標(biāo)溶液(a)、專屬性溶液(b)和純甲醇(c)色譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001進(jìn)行混合添加回收率測(cè)定，添加濃度分別為50%、75%、100%、125%、150%、200%，各3個(gè)平行，兩個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室共重復(fù)6天。結(jié)果表明，所有添加樣品中的四個(gè)脂質(zhì)體的回收率均在90%~110%之間。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

圖3. 兩個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室不同添加濃度(50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 200%)回收率（點(diǎn)擊查看大圖）

線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別配制PEG2K-DMG、CHOLE、DSPC和9001的濃度為50%、75%、100%、125%、150%、200%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定得到二次線性曲線，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表1. 脂質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)曲線

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樣品測(cè)定結(jié)果

使用上述方法，使用流動(dòng)相B對(duì)COVID-19 mRNA 疫苗樣品稀釋20倍后直接測(cè)定，樣品中脂質(zhì)體測(cè)定值與理論值接近，結(jié)果見(jiàn)下圖所示。

圖 4. 樣品及空白溶液色譜圖結(jié)果

（點(diǎn)擊查看大圖）

04

結(jié)論

本文建立了CAD檢測(cè)器測(cè)定mRNA疫苗中脂質(zhì)體含量的方法，并完成了整套的方法學(xué)驗(yàn)證及對(duì)實(shí)際疫苗樣品的測(cè)定，結(jié)果均表明此方法是可靠的、準(zhǔn)確的、無(wú)干擾的，適用于mRNA類疫苗中脂質(zhì)體的安全性和有效性質(zhì)控。

從CAD檢測(cè)器進(jìn)入2020版中國(guó)藥典的數(shù)多年，到今年4月30日美國(guó)藥典USP發(fā)布的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality"2.0草案中明確寫明脂質(zhì)表征和含量測(cè)定使用CAD檢測(cè)器。CAD檢測(cè)器得到了越來(lái)越多國(guó)內(nèi)及國(guó)外客戶的認(rèn)可及使用，協(xié)助客戶完成產(chǎn)品的研發(fā)至質(zhì)控工作。

參考文獻(xiàn)：

[1] Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines. Vaccines. 2023,11, 937. https://doi.org/10.3390 /vaccines11050937.

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