快速診斷：非洲豬瘟檢測(cè)儀器的原理與操作流程@2024全國(guó)包郵JD-PCR16D，山東競(jìng)道廠家持續(xù)更新中，非洲豬瘟(African Swine Fever, ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的高度傳染性疾病，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅?？焖偾覝?zhǔn)確的檢測(cè)是防控非洲豬瘟的關(guān)鍵。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)是目前z常用且靈敏的方法之一。以下是非洲豬瘟檢測(cè)儀器的原理與操作流程詳解：

　　原理

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)：

　　基本原理：qPCR結(jié)合了傳統(tǒng)PCR的擴(kuò)增特性與熒光檢測(cè)技術(shù)，能夠在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以定量分析目標(biāo)核酸的含量。

　　關(guān)鍵技術(shù)：

　　引物和探針設(shè)計(jì)：特異性引物和探針能夠識(shí)別并結(jié)合非洲豬瘟病毒的特定基因序列。

　　熒光標(biāo)記：探針通常標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)被釋放，激發(fā)熒光信號(hào)。

　　實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每完成一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)被實(shí)時(shí)記錄，生成熒光曲線。

　　操作流程

　　樣本采集

　　樣本類型：常用的樣本包括血液、組織(如淋巴結(jié)、脾臟)、唾液和口腔液等。

　　采集方法：使用無(wú)菌注射器從豬的耳靜脈或前腔靜脈采集血液。組織樣本需使用無(wú)菌手術(shù)器械采集。唾液樣本則通過(guò)專用唾液采集設(shè)備采集。

　　樣本標(biāo)記：確保樣本標(biāo)識(shí)清晰，包括豬只編號(hào)、采集日期、采集地點(diǎn)和采集人員等信息。

　　樣本運(yùn)輸與保存

　　運(yùn)輸條件：樣本應(yīng)置于冷藏條件下(2-8℃)運(yùn)輸，確保樣本的穩(wěn)定性。

　　保存條件：若無(wú)法立即檢測(cè)，血液樣本可在4℃保存不超過(guò)24小時(shí)，組織樣本需在-20℃或-70℃低溫冰箱中保存，避免反復(fù)凍融。

　　樣本處理與核酸提取

　　組織處理：組織樣本需剪碎并使用適當(dāng)?shù)木彌_液(如PBS)進(jìn)行勻漿處理。

　　核酸提取：按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，使用自動(dòng)化或手動(dòng)核酸提取儀從樣本中提取核酸(DNA或RNA)。

　　PCR擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

　　試劑準(zhǔn)備：按照PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，準(zhǔn)備所需的試劑，包括引物、探針、dNTPs、緩沖液、鎂離子和DNA聚合酶等。

　　反應(yīng)體系配置：將核酸模板、引物、探針等成分混合，配置成PCR反應(yīng)體系。

　　上樣：將配置好的反應(yīng)體系加入PCR管或孔板中，置于熒光定量PCR檢測(cè)儀中。

　　運(yùn)行程序設(shè)置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，設(shè)置PCR循環(huán)參數(shù)，包括變性溫度、時(shí)間，退火溫度、時(shí)間，延伸溫度、時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)。

　　運(yùn)行PCR：?jiǎn)?dòng)PCR檢測(cè)儀，儀器將按照設(shè)定的程序自動(dòng)進(jìn)行變性、退火和延伸步驟，并在每個(gè)循環(huán)中檢測(cè)熒光信號(hào)。

　　數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解讀

　　數(shù)據(jù)讀?。篜CR結(jié)束后，熒光定量PCR檢測(cè)儀自動(dòng)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。

　　數(shù)據(jù)分析：使用內(nèi)置的分析軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，計(jì)算Ct值(Cycle Threshold，循環(huán)閾值)，Ct值越低，說(shuō)明樣本中病毒含量越高。

　　結(jié)果解讀：根據(jù)Ct值和預(yù)設(shè)的閾值，判斷樣本是否為陽(yáng)性。通常，Ct值低于某一閾值(如≤35)的樣本被判定為陽(yáng)性。

　　結(jié)果報(bào)告：生成檢測(cè)報(bào)告，包括樣本編號(hào)、檢測(cè)結(jié)果(陽(yáng)性或陰性)、Ct值、檢測(cè)人員和檢測(cè)日期等信息。

　　注意事項(xiàng)

　　無(wú)菌操作：整個(gè)操作過(guò)程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免污染。

　　試劑保存：試劑需在z定條件下保存，使用前檢查有效期。

　　儀器校準(zhǔn)：定期校準(zhǔn)熒光定量PCR檢測(cè)儀，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　質(zhì)量控制：在每次檢測(cè)中包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。

　　通過(guò)上述詳細(xì)的原理與操作流程，非洲豬瘟檢測(cè)儀器能夠高效、準(zhǔn)確地完成從樣本采集到結(jié)果報(bào)告的全過(guò)程，為非洲豬瘟的防控提供科學(xué)依據(jù)。