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常見的熒光定量PCR檢測方法有哪些?

閱讀:2657      發(fā)布時間:2023-4-4
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實時熒光定量PCR,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。常見的熒光定量PCR檢測方法有SYBR Green I熒光嵌合法和熒光探針法。

SYBR Green I熒光嵌合法:
SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結(jié)合后, 熒光大大增強。因此, SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān),可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm,發(fā)射波長最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃~55℃~72℃三步法,40 個循環(huán)。SYBR Green I 的缺點:由于 SYBR Green I 沒有特異性,不能識別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光,對 PCR 反應(yīng)中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光,通常本底較高,所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。
 
SYBR Green I 的優(yōu)點:SYBR Green I 的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生,由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合,所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針,通用性較好,并且價格相對較低。這對科研是很有利的,因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。

熒光探針法:
探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(zhì)(如:FAM等),3’端帶有淬滅物質(zhì)(如:TAMRA、Eclipse、BHQ等)的探針進行熒光檢測的方法。當(dāng)探針完整時,5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約,不能檢出熒光。探針的報告基團的發(fā)射波長要在淬滅基團的吸收波長范圍內(nèi)。

能用于實時熒光 PCR 定量的方法很多,各有優(yōu)缺點,必須根據(jù)具體的實驗用途進行選擇。如果用于區(qū)別同源性高的序列以及進行SNP分型解析等多重PCR檢測,推薦用熒光探針法,而進行除此之外的Real Time PCR實驗,我們推薦使用簡單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。

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