棕紅色的燃料考馬斯亮藍G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成藍色復(fù)合物，zui大吸光度由465nm變?yōu)?95nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和燃料的結(jié)合符合比爾定律（Beer`s Law）。通過測定595nm處的光吸收值的增加量，可對蛋白質(zhì)濃度進行定量測定。

溶菌酶是一種N-乙酰細胞壁質(zhì)聚糖水解酶，該酶可以催化水解細菌細胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰胺基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，從而使細菌溶解。

本實驗以融壁微球菌（M,lysodeikticus)為底物，通過測定細菌懸液濁度的變化（OD)來測定溶菌酶的活性。

所需儀器：

儀器：

721分光光度計

材料及試劑

1、溶菌酶

2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4).

3、磷酸二氫鈉（NaH2PO4)

4、融壁微球菌（M.lysodeikticus)干粉。

5、氯化鈉（NaCl)。

6、考馬斯亮藍G-250.

7、95%乙醇。

8、85%磷酸。

9、牛血清蛋白(BSA).

實驗步驟

一、試劑配制

1、測活緩沖液；含30mmol/L，NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，ph6.2、

2、底物溶液；40mg M,lysodeikticus干粉，溶于100mL測活緩沖液中。

3、考馬斯亮藍G-250試劑；考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100ml85%磷酸 ，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過濾。（或考馬斯亮藍G-250 100mg 溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸混勻，配成原液。林用錢取原液15mL,加蒸餾水稀釋至100mL 濾紙過濾。

4、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液；用含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，PH7.0（緩沖液A)配制1mg/mL 牛血清蛋白溶液。

蛋白濃度的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定；

取14支試管，按表3.6-1分兩組進行平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測定位置樣品蛋白濃度

測定方法同上。取合適的位置樣品體積，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的的A值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計算出位置樣品的蛋白質(zhì)濃度。

酶活力的測定；

在室溫下，取2個試管，分別在1號管中加入3.0mL測活緩沖液，2.5mL底物溶液；2號管中加入2.5mL測活緩沖液，2.5mL酶液。以2號管為對照，根據(jù)不同反應(yīng)時間在721分光光度計上每個30s測定1號650nm處的光吸收值。按照系列表格記錄實驗結(jié)果。

實驗數(shù)據(jù)處理：標(biāo)準(zhǔn)品

    酶活力單位（U);酶在溫室PH6.2條件西，OD每分鐘降低0.001為1個活力單位U。根據(jù)測得結(jié)果，計算出各步數(shù)據(jù)填入表3.6-3