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常用的免疫酶染色方法

閱讀:1562        發(fā)布時間:2018/1/19
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分為以下兩種方法:

(一)酶標(biāo)抗體法 *直接法 *間接法  
(二)非標(biāo)記抗體酶法 *酶橋法 *PAP法  

 

(一)酶標(biāo)抗體法 

*通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上,制成酶標(biāo)抗體,與標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)后,再用酶組化法將酶顯色,使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,以供光鏡和電鏡觀察。 -優(yōu)點(diǎn):切片能長期保存、反復(fù)觀察,適于鏡下半定量分析。 
-缺點(diǎn):酶與抗體形成的共價鍵,可損害抗體和酶的活性;易產(chǎn)生非特異染色。  

(1) 酶標(biāo)抗體法——直接法 

將酶直接標(biāo)記在一抗上,然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物,zui后用底物顯色劑顯色。  

(2) 酶標(biāo)抗體法——間接法

*將酶標(biāo)記在二抗上,先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物,再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,zui后用底物顯色劑顯色。 (a) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟 *標(biāo)本準(zhǔn)備: -石蠟脫蠟至水; 

-冰凍切片浸入4°C丙酮固定10min,0.01M PBST漂洗,5min×3; 
-細(xì)胞爬片先用PBS洗,然后4°C丙酮固定10min,再0.01M PBST漂洗,5min×3; *石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù),其它標(biāo)本則不用; 

*封閉內(nèi)源性過氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育5~10min (濕盒內(nèi)) ; *0.01M PBST漂洗,5min×3; 

*5~10%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉,室溫孵育30min (濕盒內(nèi)) ; 

*傾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀釋的一抗, 37°C孵育60min 或4°C過夜(濕盒內(nèi)); 

*0.01M PBST 漂洗,5min×3; 

*加HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37°C 30min ; *加0.01%H2O2~0.05%DAB顯色 (顯色液應(yīng)新鮮配置); 

*經(jīng)PBS漂洗3次后,梯度酒精脫水,二甲苯透明,明膠甘油封片,顯微鏡觀察。  

 

(二)非標(biāo)記抗體酶法

酶橋法  
*首先用酶免疫動物,制備效價高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體; *以二抗作橋,將抗酶抗體聯(lián)結(jié)在一抗上; 
*再將酶結(jié)合在抗酶抗體上,經(jīng)顯色顯示抗原的分布 
-優(yōu)點(diǎn):任何抗體均未被酶標(biāo)記。酶是通過免疫學(xué)原理與酶抗體結(jié)合的。避免了共價連接對抗體和酶活性的損害,提高了方法的敏感性,而且節(jié)省一抗的用量。但抗酶抗體不易純化。  
幾點(diǎn)說明 

*一抗(假設(shè)來自種屬A)的稀釋度可大些,使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結(jié)合。 
*二抗——橋抗體(抗種屬A的IgG抗體)應(yīng)過量,使其Fab段一個與一抗結(jié)合,另一個則游離。 
*因抗酶抗體與一抗均系種屬A IgG,具有相同的抗原性,所以橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結(jié)合,起橋作用,將其連接在與組織抗原結(jié)合的一抗上。  
PAP法 
* 與酶橋法相似,不同的是,PAP 法將酶橋法的第 3、4 步并為1步,用PAP復(fù)合物代替。 *PAP是離體制備的復(fù)合物( HRP--抗 HRP)。 
*顯色與酶橋法相同,PAP復(fù)合物中的過氧化物酶催化底物水解,形成不溶性終產(chǎn)物。 PAP法評價 
*PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感。特別適用于石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。 
-缺點(diǎn):步驟較多,時間較長,不適用于臨床常規(guī)檢查。 *由于常做石蠟切片,故可用于回顧性研究。  
親和組織化學(xué)法  
*是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)。 
*這種方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。

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