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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）是抗體發(fā)揮作用的方式之一，當IgG抗體通過Fab段與靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞）表面抗原決定簇特異性結合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細胞（NK細胞、單核-巨噬細胞、中性粒細胞）等效應細胞結合，觸發(fā)效應細胞的殺傷活性，直接殺傷靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞）。

圖：抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）

ADCC檢測用Jurkat效應細胞株為改造后的NFAT-Luc-FcγRIIIa Jurkat穩(wěn)定細胞株（原始株來源于中科院細胞庫），可由CD20抗體，B細胞淋巴瘤細胞（Raji、PBMC、WIL2-S細胞系等）作為靶細胞來建立ADCC生物學活性檢測方法。YEASEN開發(fā)的Jurkat效應細胞株無菌、無支原體污染，細胞株為單克隆細胞株，可用于ADCC作用機制驗證、糖基化水平檢測、抗體篩選等應用。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

干冰運輸。收到之后如不立即復蘇，請立即轉入-80℃保存或液氮儲存。

產(chǎn)品應用

1）. Jurkat效應細胞株運輸與保存

【注】：細胞株對溫度非常敏感，避免反復凍融。收到產(chǎn)品后，如果暫時不使用，請整瓶直接放到-80℃凍存或液氮內(nèi)。

2. Jurkat細胞株復蘇使用特別注意

打開水浴鍋，等待升溫達到設置的37 ℃后，放入配制好的種子培養(yǎng)基進行預熱30±10 min，凍存管立即置于37℃水浴中解凍（控制在3 min內(nèi)），溶解*即可拿出，解凍過程中勿使水浴鍋水面浸過凍存管管口。此細胞株血清使用要求嚴格，檢測時使用推薦超低 IgG胎牛血清。（推薦：貨號:1921005PG，Gibco）

2）.抗體檢測ADCC

配制細胞：將Jurkat效應細胞、raji靶細胞株200 g或1000 rpm 離心5 min 后用ADCC緩沖液（RPMI 1640培養(yǎng)基+4%低IgG FBS）重懸洗滌一次后，計數(shù)，調(diào)節(jié)活細胞密度（raji推薦5E5 Cells/mL；Jurkat推薦3E6 Cells/mL）可進行調(diào)試標靶比， Jurkat效應細胞株密度建議不調(diào)整。細胞株活率＞95%。方可進行實驗。一般活率在98-99%之間。

稀釋抗體：將抗體調(diào)節(jié)較高濃度成20 µg/mL后，進行梯度稀釋，低濃度時如3 µg/mL可按2-3倍進行梯度稀釋；高濃度可按5倍稀釋。先確定細胞的檢測抗體濃度范圍后，再進行濃度和梯度稀釋比例的調(diào)整。

1、將75 µL ADCC Buffer添加到96孔板的最外面的孔中，封液，防止蒸發(fā)。

2、輕輕吹打raji細胞懸液，加入25 µL細胞懸液每孔。

3、從抗體稀釋板中每孔加入25 µL抗體稀釋系列，加入到細胞孔內(nèi)。空白不加抗體，加入25 µL ADCC緩沖液。建議從低濃度到高濃度進行添加。

4、輕輕吹打Jurkat效應細胞懸液，然后在實驗臺上添加25 µL Jurkat效應細胞，則每孔抗體濃度稀釋三倍。（母液濃度為3 µg/mL，則檢測起始起始濃度為1 µg/mL。）

5、用蓋子蓋住板，在37°C加濕的CO₂中孵育6小時。

6、從37°C的培養(yǎng)箱中取出檢測板，并將其平衡到環(huán)境溫度(22-25°C)，一般放置20-30 min即可。

7、使用手動多通道移液管，添加75 µL Bio-Glo™熒光素酶分析試劑到所有內(nèi)部96孔板；避免制造任何泡沫。孵育5分鐘后用酶標儀在白板中讀取相對光單位（relative light units,RLU）數(shù)值，并按照以反應-陰性作圖。

陰性：Jurkat效應細胞株+靶細胞，不含抗體，Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit檢測值

反應：Jurkat效應細胞株+靶細胞，含抗體，Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit檢測值

例：TECAN Spark 酶標儀檢測設置：Luminescence，360-700 nm，實驗檢測時間設為10000 m sec；settle time：1 sec；

SpectraMax M5酶標儀檢測使用設置：Luminescence，All  nm，實驗檢測時間設為500-1000m sec；settle time：1 sec。

3）實驗結果

①抗體檢測：

TECAN Spark 酶標儀檢測設置：Luminescence，360-700 nm，實驗檢測時間設為10000 m sec；settle time：1 sec；

使用3 µg/mL母液抗體濃度，按2.5倍稀釋，稀釋13倍；抗體為：Rituximab, E:T=6:1

圖：檢測值比較明顯值在(log -10至-6的區(qū)間內(nèi))

注意事項

1、反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用。

2、Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit應在環(huán)境溫度不超過27℃使用，使用時解凍后繼續(xù)在室溫下孵育20-30分鐘，和96孔白板溫度保持一致。

3、檢測儀器：能檢測化學發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置檢測時間段和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同。

4、檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標板。

5、本產(chǎn)品僅作科研用途，禁止應用于人體。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

HB220330