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細胞技術(shù)專題:細胞傳代實驗

2014-3-3  閱讀(1037)

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根據(jù)細胞生長的恃點,傳代方法有3種:懸浮生長細胞傳代、半懸浮生長細胞傳代(Hela細胞)、貼壁生長細胞傳代。

實驗方法

  • 細胞培養(yǎng)技術(shù)
  • 消化法
實驗方法原理培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打傳代。
實驗材料

細胞

試劑、試劑盒

D-Hanks液 小牛血清 RPMI1640 雙抗 胰蛋白酶 EDTA NHCl NaHCO3

儀器、耗材

凈化工作臺 離心機 恒溫水浴箱 冰箱 倒置相差顯微鏡 培養(yǎng)箱 吸管 玻璃瓶 培養(yǎng)瓶 廢液缸 吸頭 槍頭 膠塞 離心管 量加樣槍 紅血球計數(shù)板

實驗步驟

1.  貼壁細胞的消化法傳代:


(1)吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。


(2)D-Hanks液洗2~3次。

 

(3)向瓶內(nèi)加入適量消化液(胰蛋白酶或與EDTA混合液)輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細胞表面。

(4)然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液,輕輕搖動再倒掉大部分消化液,僅留少許進行消化(也可不采用上述步驟直接加消化液進行消化)。

 

(5)消化在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進行。

(6)消化2~5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察,發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,細胞間隙增大后,應(yīng)立即終止消化。

 

(7)吸除或倒掉消化液,如用EDTA消化,需加Hanks液數(shù)毫升,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉。

(8)再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液,終止消化。

 

(9)用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,反復(fù)吹打瓶壁細胞,吹打過程要順序進行。

(10)從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束,以確保所有底部都被吹到,使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。 

 

(11)計數(shù),分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

 

2.  懸浮細胞的傳代:懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代,或直接傳代。


離心傳代法:


(1)將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

 

(2)離心800~1000 rpm,5 min。

 

(3)棄去上清,加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi),用吸管吹打形成細胞懸液。

 

(4)計數(shù),分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

 

(5)直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后,將上清液吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。


3.  部分貼壁細胞的傳代


(1)部分貼壁不牢的細胞,如Hela細胞等,不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來,而進行傳代。

(2)對絕大部分貼壁生長的細胞,因直接吹打?qū)毎麚p傷較大,細胞常有較大數(shù)量的丟失,因而需消化后,才能吹打傳代。

收起 
注意事項

1.  胰蛋白酶要預(yù)溫,溫度37℃左右為宜℃。


2.  離心轉(zhuǎn)速要合適,轉(zhuǎn)速過低,不能有效分離細胞,離心速度過大,時間過長,會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。


3.  要定時觀察細胞,發(fā)現(xiàn)污染,應(yīng)及時處理。

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