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細(xì)胞技術(shù)專題:大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2014-3-3  閱讀(1137)

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實(shí)驗(yàn)方法

  • 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
實(shí)驗(yàn)方法原理選用Wistar大鼠經(jīng)消化酶灌注肝臟后,用分離液分離HSC,通過觀察其自發(fā)熒光及其顯著特征性結(jié)構(gòu)的脂肪染色、細(xì)胞免疫化學(xué)染色等方法鑒定。
實(shí)驗(yàn)材料

雄性 SD 大鼠

試劑、試劑盒

戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺(tái)盼蘭

儀器、耗材

手術(shù)器械 尼龍網(wǎng) 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)步驟
 

1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹,進(jìn)行門靜脈插管。

 

2. 以D-Hanks’液灌注,同時(shí)剪開下腔靜脈,沖掉血液后,改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。

 

3. 待肝臟變軟后,離體肝臟并剪碎,繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min,尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃,下同)。

 

4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml,再混以20 ml Nycodenz 液,分置于離心管中,并分別覆以2-3 ml HBSS,1450 g 離心16 min 后取界面細(xì)胞。

 

5. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞,以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并判斷存活率和產(chǎn)量,zui后按照常規(guī)方法接種(10細(xì)胞/cm),次日換液,以后每2-3 天換液一次。

 

6. 傳代方法:棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次,加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化,鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右),以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA,可以不需離心), 充分吹打后以 1:2-1:3 接種,然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2,37℃)。


二、結(jié)果

接種次日,光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀,胞質(zhì)內(nèi)有脂滴,熒光鏡下328  nm 處見自發(fā)熒光。附照片(圖 1)。

 

圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細(xì)胞

收起 
其他一、討論

進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化:Desmin 和α-SMA;后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。也采用過無(wú)須原位消化的方案,*可行,只不過消化時(shí)間更難控制!實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5 代以內(nèi))。

二、文獻(xiàn)
 

1. 袁桃霞,張錦生,張?jiān)露?,? 大鼠肝 Ito 細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué) 學(xué)報(bào),1996,23(2):90-93.


2. Huang GC, Zhang JS, Tang . Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic slate cells. Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1309-1318.

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