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實(shí)驗(yàn)方法
- 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 選用Wistar大鼠經(jīng)消化酶灌注肝臟后,用分離液分離HSC，通過觀察其自發(fā)熒光及其顯著特征性結(jié)構(gòu)的脂肪染色、細(xì)胞免疫化學(xué)染色等方法鑒定。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 雄性 SD 大鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺(tái)盼蘭 |
| 儀器、耗材 | 手術(shù)器械 尼龍網(wǎng) 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管。
2. 以D-Hanks’液灌注，同時(shí)剪開下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。
3. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。
4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g 離心16 min 后取界面細(xì)胞。
5. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，zui后按照常規(guī)方法接種(105 細(xì)胞/cm2 )，次日換液，以后每2-3 天換液一次。
6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2，37℃)。
接種次日，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm 處見自發(fā)熒光。附照片(圖 1)。
圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細(xì)胞 收起 |
| 其他 | 一、討論 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin 和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。也采用過無(wú)須原位消化的方案，*可行，只不過消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5 代以內(nèi))。 二、文獻(xiàn) 1. 袁桃霞，張錦生，張?jiān)露?，? 大鼠肝 Ito 細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué) 學(xué)報(bào),1996,23(2):90-93.
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