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大鼠

MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液

眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

1. SD 大鼠經(jīng)低溫麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預(yù)冷的D-Hanks’液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。

2. 剪碎組織成1 mm³ 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次。

3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。

4. 吸出組織轉(zhuǎn)移到另一支裝有冷的 GM 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2～3 次。

5. 所得上清于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液并吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1.5×10⁵/cm² 種入 25 cm² 培養(yǎng)瓶，放入孵箱培養(yǎng)。以后每隔2～3 d 進(jìn)行全量換液。

6. 搖床振搖分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞：培養(yǎng)至7～10 天，換液后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出擰緊培養(yǎng)瓶蓋，于37℃恒溫?fù)u床上280 rpm 搖 動(dòng)18 h。此時(shí)寡突膠質(zhì)細(xì)胞 90%以上在培養(yǎng)懸液內(nèi)而與瓶底貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離。

7. 分離培養(yǎng)懸液內(nèi)的少突膠質(zhì)細(xì)胞：吸出懸液至離心管內(nèi)950  rpm 離心10  min，棄上清后管內(nèi)加入新鮮GM，吹打成單細(xì)胞懸液，按1.5×10⁵/cm² 種入預(yù)先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的 35 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)。24 h 后換成DF12＋N2 的無血清 培養(yǎng)液，此后每三天半量換液1 次。

8. 瓶底星形膠質(zhì)細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng)：25 cm² 培養(yǎng)瓶內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-Hanks’液洗2 次后常規(guī)傳代，以 1.5×10⁵/cm² 種入預(yù)先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的35 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)液為GM，每三天半量換液1 次。附GFAP鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞圖片。

圖1：星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP 鑒定)

大鼠

CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12

水浴鍋 培養(yǎng)箱

一、原代培養(yǎng)

1.  選用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，斷頭取其大腦皮層組織。
 

2.  解剖顯微鏡下，剝離腦膜，切除大腦髓質(zhì)部分。
 

3.  將大腦皮質(zhì)在無Ca²⁺、Mg²⁺Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
 

4.  室溫下靜置10 min。
 

5.  在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
 

6.  加入少許含20%血清的DMEM/F12(DMEM與F12為1:1)混合培養(yǎng)液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液與培養(yǎng)液混勻。離心5 min(1 000 r/min)。
 

7.  吸去上清含酶液，重新加入含血清培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打至組織塊消散為止。制成細(xì)胞懸液(暫稱初細(xì)胞懸液)。
 

8.  將初細(xì)胞懸液接種到玻璃瓶(或培養(yǎng)皿)中，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育30 min。
 

9.  翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,吸出瓶中的細(xì)胞懸液。用孔徑為75μm的不銹鋼網(wǎng)過濾。
 

10.  將濾過液離心10 min(1 000 r/min)，濃縮成約3ml的細(xì)胞懸液(暫稱為次細(xì)胞懸液)。
 

11.  將次細(xì)胞懸液種植到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。接種的細(xì)胞密度約1×10⁴個(gè)/cm²。
 

12.  置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5h,再補(bǔ)加足夠的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)9-14 h。培養(yǎng)液顏色略微變黃時(shí)換液。

二、原代培養(yǎng)物的傳代
 

1.  吸取舊培養(yǎng)液用CMF-Hanks液洗滌2次。
 

2.加入少許0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培養(yǎng)液終止胰酶活性。
 

3.稍事手動(dòng)搖晃,倒掉含酶液。加入有血清培養(yǎng)液。
 

4.用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落。收集細(xì)胞懸液,離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液，給細(xì)胞沉淀物再加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。
 

5.重復(fù)原代培養(yǎng)時(shí)8-10步。
 

6.將細(xì)胞懸液按0.5×10⁵個(gè)/cm²的密度種植在經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中。
 

7.送入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 h，再加足夠的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

三、結(jié)果

分離的大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞在原代培養(yǎng)4 h后，部分細(xì)胞即可長出細(xì)小胞突。培養(yǎng)3-4 d之后，細(xì)胞數(shù)量便明顯增大。大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)一般在9-14 d，以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶壁。