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細(xì)胞技術(shù)專題:大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2014-2-25  閱讀(1392)

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標(biāo)簽: 大鼠 大腦皮層 神經(jīng)元

大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)可以:(1)獲得大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞;(2)用于神經(jīng)元細(xì)胞定向分化研究;(3)用于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡研究。

實(shí)驗(yàn)方法

  • 機(jī)械性劃割培養(yǎng)
  • 酶消化法
實(shí)驗(yàn)方法原理SD胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d,微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內(nèi)機(jī)械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)元,依劃割程度不同分為輕、中、重3組,對照組除不進(jìn)行機(jī)械性劃割,其余處理同損傷組,傷后不同時間點(diǎn)(10,30min , 1,3,6,12,24 h)檢測細(xì)胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量。
實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠

試劑、試劑盒

硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’

儀器、耗材

眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)步驟

 

1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚,依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜,無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的 D-Hanks’平衡鹽液中。

 

2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層,除去腦膜,剪碎組織成約1mm3 大小,加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min,中間搖晃一次。

 

3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。

 

4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM+10%FBS 的離心管內(nèi),用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次,靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2~3 次。

 

5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。

 

6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min,棄上清,管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM+20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。

 

7. 細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2  種入6 孔板內(nèi),放入CO孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1×10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。

收起 
注意事項(xiàng)

1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進(jìn)行改動:如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右,也可用 DNA 酶進(jìn)行消化,有人還直接進(jìn)行吹打,都可行。

 

2. 上面雖然時大鼠皮層神經(jīng)元,但是同樣適用于小鼠,但是應(yīng)該選擇孕13 d 左右的小鼠。

 

3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞,因此在接種時細(xì)胞的密度一定要夠。

 

4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時,一定要注意玻片的來源和處理方法,這個非常重要,對神經(jīng)細(xì)胞的影響 是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長情況還不錯的話,那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片。

 

5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基,那么就方便了(不用加 AraC):

 

(1)把細(xì)胞懸液用(DMEM+20%FBS)懸浮,種到培養(yǎng)皿上6-12 h 后,全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),3 d 半量換液。

 

(2)把細(xì)胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種。

 

(3)可以用新生1 d 內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。

 

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