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細胞技術(shù)專題:PI3K/Akt/mTOR信號通路

2014-2-13  閱讀(1612)

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目的:通過特異性阻斷PI3K和mTOR,觀察HepG2和Hep3B細胞株P(guān)I3K/Akt/mTOR信號通路活性及生物學行為的改變,探討相關(guān)的分子機制。

 

方法:在培養(yǎng)的HepG2、Hep3B人肝癌細胞株和人正常肝細胞株QSG-7701上,以免疫印跡方法(Western blot)檢測各細胞株中PI3K(p110α亞單位)、PTEN、pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達情況;分別用 PI3K抑制劑LY294002(50μmol/ml)和mTOR抑制劑Rapamycin(RAPA,50 nmol/ml)孵育HepG2和Hep3B細胞,以MTT比色法檢測細胞的增殖能力,以流式細胞術(shù)(Flow cytometry)檢測細胞周期和凋亡情況,以Western blot法檢測細胞中pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表達改變。

 

結(jié)果:PTEN在HepG2和Hep3B細胞中基本無表達,在QSG-7701細胞株中高表達,pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B細胞中的 表達較QSG-7701細胞均顯著升高;LY294002和RAPA均呈劑量-時間依賴的抑制HepG2和Hep3B細胞生長。飽和效應(yīng)濃度的 LY294002和RAPA作用24小時后,HepG2和Hep3B細胞均呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,處于S期的細胞比例較對照組顯著減少 (P<0.01);兩給藥組中HepG2細胞和Hep3B細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加(P<0.01);兩給藥組HepG2細胞的凋 亡率顯著高于Hep3B細胞(P<0.01或P<0.05),并且HepG2細胞的凋亡率在RAPA給藥組顯著高于LY294002給藥組 (P<0.01),但Hep3B細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。飽和效應(yīng)濃度的LY294002作用48小時后,HepG2和Hep3B細胞中 pAkt(T308,S473)和p-mTOR(S2448)的表達水平較對照組均顯著降低(P<0.01),飽和效應(yīng)濃度的RAPA作用48小時 后,HepG2和Hep3B細胞中P-mTOR(S2448)的表達水平較對照組均顯著降低(P<0.01),而pAkt(T308,S473)的 表達水平較對照組均顯著升高(分別P<0.01)。

 

結(jié)論:(1)HepG2和Hep3B細胞存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的組成性激活;(2)LY294002和RAPA能有效阻斷HepG2和 Hep3B細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制HCC細胞的生長增殖,誘導細胞周期阻滯,促進細胞凋亡,且阻斷效應(yīng)與HCC細胞P53的表達有 關(guān);(3)一定濃度范圍內(nèi),HepG2細胞對PI3K/Akt/mTOR信號通路阻斷劑的敏感性高于Hep3B細胞,RAPA對PI3K/Akt /mTOR信號通路的部分阻斷效應(yīng)優(yōu)于LY294002。

 

目的:觀察阿霉素(Doxorubicin,DOX)單用或與RAPA聯(lián)合用藥對HepG2和Hep3B細胞生物學行為及PI3K/Akt/mTOR信號通路活性的影響,探討mTOR抑制劑增強HCC化療藥物療效的相關(guān)作用機制。

 

方法:分別取對數(shù)生長期的HepG2和Hep3B細胞,以不同濃度的DOX單用或與RAPA(20 nmol/ml)聯(lián)合應(yīng)用培養(yǎng)48h或24h,以MTT法測定藥物對HepG2和Hep3B細胞的增殖抑制作用,以流式細胞技術(shù)檢測二者的凋亡情況,以 Western blot法檢測者P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)的表達改變。

 

結(jié)果:0.156~2.5 mg/L濃度范圍內(nèi),DOX能抑制HepG2和Hep3B細胞的增殖,且呈濃度依賴性;DOX在0.625~10mg/L濃度范圍內(nèi),Hep3B細胞的相 對存活率顯著大于HepG2細胞(P<0.01);與DOX單用比較,DOX(0.156~2.5mg/L)與RAPA聯(lián)用顯著降低了HepG2和 Hep3B細胞的存活率(P<0.01或P<0.05),DOX(0.156~10mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細胞存活率顯著大于 HepG2細胞(P<0.01)。DOX(0.156~10mg/L)單用或與RAPA聯(lián)用24h均可誘導HepG2和Hep3B細胞凋亡發(fā)生,且 隨DOX濃度增加,凋亡牢升高;與DOX單用比較,DOX(1.25~10mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細胞捌亡率較顯著升高 (P<0.01或P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,Hep3B細胞凋亡率顯著升高(分別P<0.05);DOX(5.0~10mg/L)單用,HepG2細胞凋亡率顯著大 于Hep3B細胞(分別P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)與RAPA聯(lián)用,HepG2細胞凋亡率顯著大于Hep3B細胞(分別P<0.01)。RAPA(20nmol/L)、DOX(2.5mg /L)以及二者聯(lián)用均可導致HepG2或Hep3B細胞P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)表達減 少,且以DOX與RAPA聯(lián)用效應(yīng)zui為明顯。

 

結(jié)論:(1)DOX可抑制HepG2和Hep3B細胞生長增殖,促進細胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度;(2)DOX與 RAPA聯(lián)合用藥能顯著抑制HepG2和Hep3B細胞的增殖,促進細胞凋亡,下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度,并在一定濃度范圍內(nèi)表 現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng);(3)在一定濃度范圍內(nèi),HepG2細胞對DOX單用或與RAPA聯(lián)合用藥的敏感性顯著高于Hep3B細胞,可能與HCC細胞p53的表達 差異有關(guān)。

 

目的:分析人HCC組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化水平與p53的表達及HCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,評估PI3K/Akt/mTOR信號通路在HCC診斷和預后評價中的作用。

 

方法:76例HCC組織樣本經(jīng)臨床病理分期分級后,以免疫組織化學方法檢測HCC組織和癌旁組織中p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6的表達情況,分析上述指標在不同HCC病理特征條件下的陽性表達率,并與正常肝組織比較。

 

結(jié)果:p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6在人HCC組織有不同程度的表達,HCC組織p53(60.5%,46/76)、 pAkt(92.1%,70/76)、p-mTOR(84.2%,64/76)和pS6(88.2%,67/76)的陽性表達比例較癌旁肝組織(分別為 10.5%,8/76、63.2%,48/76、46.1%,35/76、52.6%,40/76)和正常肝組織(分別為0%、55.0%,11/20、 50.0%,10/20、45.0%,9/20)顯著升高(P<0.01),而PTEN(65.8%,50/76)的陽性表達比例較癌旁肝組織 (89.5%,68/76)和正常肝組織(85.0%,17/20)顯著減少(P<0.05);p53陽性表達HCC組織pAkt、p-mTOR和 pS6的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著升高(P<0.01),而PTEN的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著降低(P<0.01)。低分 化、存在血管侵襲、TNM分期高的HCC組織p53、pAkt、p-mTOR和pS6的陽性表達率較相對應(yīng)的分化較好、無血管侵襲、TNM分期低的HCC 組織顯著升高(分別P<0.01或P<0.05);而PTEN的陽性表達率顯著降低(分別P<0.01或P<0.05)。

 

結(jié)論:(1)人HCC組織存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活;(2)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度與p53的表 達可能有相關(guān)性;(3)人HCC組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化程度與HCC的臨床病理特征有關(guān),活化程度越高的HCC其分化程度越低、血管侵襲多發(fā)、TNM分期高。

 

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