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細胞技術(shù)專題:細胞原代培養(yǎng)實驗

2014-2-13  閱讀(1378)

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標簽: 細胞 原代培養(yǎng)

細胞原代培養(yǎng)可以:(1)為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;(2)為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件;(3)服務于臨床實踐,用于藥物篩選等。

實驗方法

  • 胰酶消化法
  • 組織塊直接培養(yǎng)法
實驗方法原理將動物機體的各種組織從機體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。因此,較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì),如果是正常細胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實際上,通常把*代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。zui常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。

 

實驗材料

胎鼠 新生鼠

試劑、試劑盒

1640培養(yǎng)基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒

儀器、耗材

培養(yǎng)箱 培養(yǎng)瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術(shù)器械 血球計數(shù)板 離心機 水浴箱

實驗步驟一、實驗材料準備
 

1.  Hank’s液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作


1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2-3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi))再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)(或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi))解剖取肝臟,置平皿中。

 

2.  用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結(jié)締組織,血液等雜物。

 

3.  用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊(1 mm2),再用Hank’s液洗三次,轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。

 

4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。

 

5.  加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。

 

6.  靜置5-10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。

 

7.  1 000 rpm,離心10分鐘,棄上清液。

 

8.  加入Hank’s液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。

 

9.  加入培養(yǎng)液1-2 ml(視細胞量),血球計數(shù)板計數(shù)。

 

10.  將細胞調(diào)整到5×105/ml左右,轉(zhuǎn)移至25 ml細胞培養(yǎng)瓶中,37℃下培養(yǎng)。

 

收起 
注意事項

1.  自取材開始,保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
 

2.  在超凈臺中,組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久,以免溶液蒸發(fā)。
 

3.  凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細菌落入。
 

4.  操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
 

5.  點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
 

6.  操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
 

7.  不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
 

8.  瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
 

9.  吸溶液的吸管等不能混用

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