一、背景

溶壁微球菌細胞是一種菌落呈黃色，細胞為球形,直徑0.5-3.5微米的細菌。一般為單生、對生何特征性的向幾個平面分裂而形成不規(guī)則的堆團，四聯(lián)或立方堆。

溶壁微球菌細胞常常不運動。溶壁微球菌細胞未知有休眠階段；革蘭氏陽性；化能異養(yǎng)菌，代謝為嚴格的呼吸型。溶壁微球菌細胞產(chǎn)生接觸酶；好氧；生長溫度為25℃-30℃；DNA的G+C含量為66-75%。

二、溶壁微球菌培養(yǎng)方法主要包括：

1、溶壁微球菌培養(yǎng)基的制備：將添加適量的營養(yǎng)物質(zhì)、碳源和氮源混合溶解，攪拌均勻，加入適量的水，經(jīng)加熱消毒后，即可得到溶壁微球菌培養(yǎng)基。

2、溶壁微球菌的接種：將溶壁微球菌懸浮液滴入溶壁微球菌培養(yǎng)基中，搖動均勻，加入蓋玻片，然后置于25℃的恒溫箱中，經(jīng)24小時培養(yǎng)，即可得到溶壁微球菌的培養(yǎng)。

3、溶壁微球菌的分離：將溶壁微球菌培養(yǎng)液用濾篩分離，收集濾液，再置于25℃的恒溫箱中，經(jīng)24小時培養(yǎng)，即可得到溶壁微球菌的分離。

4、溶壁微球菌的純化：將溶壁微球菌分離液滴入溶壁微球菌純化培養(yǎng)基中，搖動均勻，加入蓋玻片，然后置于25℃的恒溫箱中，經(jīng)24小時培養(yǎng)，即可得到溶壁微球菌的純化。

溶壁微球菌不耐熱。微生物菌種應(yīng)保藏于低溫、清潔和干燥的地方，室溫放置時間過長會導致菌種衰退。溶壁微球菌具體用于溶菌試驗。

三、應(yīng)用

溶壁微球菌細胞可以用于大菱鲆熱休克蛋白Hsp47的功能研究：

以高溫脅迫條件下,皮膚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩得的熱休克蛋白47(HSP47)基因為研究對象,運用細菌結(jié)合、凝集及抑制等試驗方法對其免疫功能等進行研究,分析HSP47在高溫脅迫條件下大量表達的原因,并通過對關(guān)鍵位點的定點突變,高效地分析其所表達的目的蛋白的性狀及表征,從而分析HSP47蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系。

大菱鲆熱休克蛋白Hsp47對病原相關(guān)分子模式的刺激響應(yīng)。通過RACE技術(shù)克隆SmHsp47的c DNA全長1927bp,并進行了生物信息學分析,與其他物種的序列比對顯示,分別存在42.76%-81.25%的氨基酸序列一致性。對大菱鲆進行病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns,PAMP)脂多糖(LPS)和磷壁酸(LTA)的刺激,探討SmHsp47基因?qū)ζ浯碳ろ憫?yīng),q PCR實驗結(jié)果顯示,SmHsp47對LTA具有明顯的刺激響應(yīng)。

大菱鲆熱休克蛋白Hsp47的免疫相關(guān)功能研究。利用已克隆得到的完整SmHsp47基因序列,構(gòu)建了原核表達載體,經(jīng)誘導表達,最終鑒定目的蛋白主要以包涵體的形式進行表達,對目的蛋白進行重組復(fù)性,得到SmHsp47重組蛋白。對重組蛋白進行了三種絲氨酸蛋白酶抑制活性的研究,結(jié)果顯示SmHsp47對三種絲氨酸蛋白酶均無抑制活性,屬于非抑制型。

利用重組蛋白對細菌進行結(jié)合,實驗結(jié)果顯示,SmHsp47與嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、鰻弧菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌相互作用,說明SmHsp47可能在細菌攻擊期間的免疫防御的方面起作用,可能用于識別入侵細菌;在體外細菌凝菌與抑制活性試驗中,SmHsp47重組蛋白特異性的對溶壁微球菌有凝菌及抑菌活性;運用His-pull down技術(shù)篩選出在魚體總蛋白中與SmHsp47相互作用的蛋白,為進一步分析SmHsp47的功能提供參考。

通過定點突變分析氨基酸位點對大菱鲆免疫相關(guān)功能的影響。為了了解SmHsp47結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,選取了幾個關(guān)鍵的氨基酸位點進行了定點突變,然后分析SmHsp47活性的關(guān)鍵位點。

本實驗構(gòu)建了5個SmHsp47基因的突變表達載體,通過對溶壁微球菌的結(jié)合、凝集以及抑制活性實驗得出以下結(jié)論,Leu368和Tyr370的突變能夠影響SmHsp47蛋白的可溶性表達,從而增加體外抑菌活性,而Ary209、Asp372、Asp350-Asn366和Arg402-Leu405均不影響SmHsp47蛋白對溶壁微球菌的結(jié)合、凝集以及抑制細菌活性?？傊?本研究結(jié)果表明SmHsp47對革蘭氏陽性菌有明顯的刺激響應(yīng),對溶壁微球菌有明顯的凝集與抑菌作用。

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