胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙是一類常見的疾病，包括食管失弛緩癥、胃輕癱、腸假性梗阻和慢性便秘等。這些疾病通常與腸道神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）中抑制性NO產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能障礙有關(guān)。由于缺乏有效的治療方法，這些疾病對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。

利用hPSCs開發(fā)一個(gè)能夠模擬人類ENS的體外模型，包括二維（2D）ENS培養(yǎng)和三維（3D）神經(jīng)節(jié)類器官。這些模型不僅能夠模擬ENS的發(fā)育過程，還能用于藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。通過單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，詳細(xì)分析NO神經(jīng)元的分子特征，并通過高通量小分子篩選，發(fā)現(xiàn)了能夠調(diào)節(jié)NO神經(jīng)元活性的藥物。

Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯(lián)芯片3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)

（一）構(gòu)建能夠模擬人類腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的3D腸神經(jīng)節(jié)類器官模型。這些模型不僅能夠用于研究腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育機(jī)制，還可以用于藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)研究。

1. hPSCs的培養(yǎng)和維持

- 使用hESC（人類胚胎干細(xì)胞）系H9（WA09-WiCell）或iPSC（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）系WTC-11。

- hPSCs在Geltrex包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用E8培養(yǎng)基進(jìn)行維持。

- 每30天檢測(cè)一次支原體污染。

2. ENCC（腸神經(jīng)嵴細(xì)胞）的誘導(dǎo)

- 當(dāng)hPSCs單層培養(yǎng)達(dá)到約70%匯合時(shí)，開始12天的ENCC誘導(dǎo)方案。

- 第0天：吸去E8培養(yǎng)基，替換為神經(jīng)嵴誘導(dǎo)培養(yǎng)基A（含有BMP4、SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養(yǎng)基）。

- 第2天和第4天：使用神經(jīng)嵴誘導(dǎo)培養(yǎng)基B（含有SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養(yǎng)基）。

- 第6天、第8天和第10天：使用培養(yǎng)基C（培養(yǎng)基B中加入視黃酸）。

- 第12天：吸去培養(yǎng)基C，用Accutase處理ENCC單層細(xì)胞（30分鐘，37°C，5% CO?），離心后將ENCC重懸于NC-C培養(yǎng)基（含有FGF2、CHIR 99021、N2補(bǔ)充劑、B27補(bǔ)充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基）中，轉(zhuǎn)移到超低吸附板中形成自由懸浮的3D腸神經(jīng)嵴球體（enteric crestospheres）。

3. 腸神經(jīng)元的誘導(dǎo)

- 第15天：將腸神經(jīng)嵴球體聚集到孔中心，移除NC-C培養(yǎng)基，根據(jù)最終培養(yǎng)布局（2D ENS培養(yǎng)或3D腸神經(jīng)節(jié)類器官）進(jìn)行不同處理。

- 對(duì)于3D腸神經(jīng)節(jié)類器官：

- 避免使用Accutase處理，直接向腸神經(jīng)嵴球體中加入相同體積的腸神經(jīng)元培養(yǎng)基（含有GDNF、抗壞血酸、N2補(bǔ)充劑、B27補(bǔ)充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基）。

- 每隔一天更換一次腸神經(jīng)元培養(yǎng)基，直到第30-40天，之后可以減少更換頻率，但需增加更換培養(yǎng)基的量。

4. 3D腸神經(jīng)節(jié)類器官的培養(yǎng)和維護(hù)

- 在第15天之后，腸神經(jīng)嵴球體在腸神經(jīng)元培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，逐漸分化為腸神經(jīng)節(jié)類器官。

- 培養(yǎng)過程中，每隔一天更換一次培養(yǎng)基，直到第30-40天。

- 從第40天開始，可以減少更換培養(yǎng)基的頻率，但需增加每次更換的培養(yǎng)基量，以維持類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。

5. 功能驗(yàn)證和分析

- 免疫熒光染色：用于檢測(cè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，驗(yàn)證類器官中不同細(xì)胞類型的形成。

- 單細(xì)胞RNA測(cè)序：用于分析類器官中細(xì)胞類型的分子特征，鑒定NO神經(jīng)元等特定亞型。

- 鈣成像和電生理記錄：用于評(píng)估神經(jīng)元的活性和功能成熟度。

- 藥物篩選和功能測(cè)試：通過高通量篩選，鑒定能夠調(diào)節(jié)NO神經(jīng)元活性的化合物，并在體外和體內(nèi)模型中驗(yàn)證其功能。

（二）在進(jìn)行類器官傳代時(shí)，需要注意以下幾個(gè)關(guān)鍵事項(xiàng)

1. 傳代前的準(zhǔn)備

- 培養(yǎng)基準(zhǔn)備：確保使用適合類器官生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如含有特定生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子的培養(yǎng)基。對(duì)于腸類器官，可以使用成熟商業(yè)化類器官生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

- 基質(zhì)準(zhǔn)備：使用適合的細(xì)胞外基質(zhì)材料，如Matrigel，以支持類器官的三維結(jié)構(gòu)。

- 工具和材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好所有需要的工具和材料，如溫和細(xì)胞解離試劑、離心管、移液槍頭等，并確保它們處于適當(dāng)溫度（如4°C或室溫）。

2. 類器官的處理

- 觀察和評(píng)估：在顯微鏡下觀察類器官，確保其健康狀態(tài)良好。

- 溫和解離：使用溫和的細(xì)胞解離試劑（如TrypLE或Gentle Cell Dissociation Reagent）來解離類器官，避免對(duì)細(xì)胞造成損傷。

- 避免過度解離：解離時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免損傷細(xì)胞。對(duì)于小鼠腸類器官，室溫下孵育1分鐘即可。

3. 離心和重懸

- 離心條件：以適當(dāng)?shù)碾x心力（如290×g，4°C，5分鐘）離心，以收集類器官。

- 重懸：使用預(yù)冷的培養(yǎng)基或基質(zhì)重懸類器官，避免產(chǎn)生氣泡。

4. 接種和培養(yǎng)

- 基質(zhì)和類器官混合：將類器官與Matrigel等基質(zhì)混合后，快速接種到培養(yǎng)板中，形成凝固的dome。

- 培養(yǎng)條件：確保培養(yǎng)板在37°C、5% CO?的條件下培養(yǎng)，以促進(jìn)Matrigel的凝固和類器官的生長(zhǎng)。

- 避免直接接觸：加入培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)避免直接沖擊dome，以免破壞其結(jié)構(gòu)。

5. 培養(yǎng)后的維護(hù)

- 定期換液：每周進(jìn)行三次換液，以維持類器官的生長(zhǎng)。

- 監(jiān)控生長(zhǎng)：定期觀察類器官的生長(zhǎng)情況，確保其健康和正常發(fā)育。

- 傳代比例：根據(jù)類器官的生長(zhǎng)速度，選擇合適的傳代比例（如1:2至1:6）。

6. 其他注意事項(xiàng)

- 傳代頻率：根據(jù)類器官的生長(zhǎng)情況，定期進(jìn)行傳代，通常每7至10天進(jìn)行一次。

- 冷凍保存：在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，可以將類器官進(jìn)行冷凍保存，以便后續(xù)使用。

- 基因穩(wěn)定性：長(zhǎng)時(shí)間傳代可能導(dǎo)致類器官的基因穩(wěn)定性發(fā)生變化，因此需要定期進(jìn)行基因檢測(cè)。

（三）展望：結(jié)合Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建系統(tǒng)，確保3D腸-腦類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)

1. 優(yōu)化培養(yǎng)基和灌流條件

- 培養(yǎng)基成分：使用適合腸神經(jīng)節(jié)類器官的培養(yǎng)基，如含有GDNF、抗壞血酸、N2補(bǔ)充劑、B27補(bǔ)充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基。此外，可以參考其他研究中使用的培養(yǎng)基成分，如添加RSPO1、EGF、PGE2等，這些成分對(duì)于維持腸干細(xì)胞的增殖和功能至關(guān)重要。

- 灌流參數(shù)：通過Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng) 精確控制灌流參數(shù)，如流速、流量等，確保類器官之間的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞接近體內(nèi)真實(shí)生理狀態(tài)。

2. 模擬體內(nèi)微環(huán)境

- 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：使用適合的基質(zhì)材料，如Matrigel，來模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。Matrigel是一種常用的基質(zhì)，能夠提供必要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，支持類器官的三維結(jié)構(gòu)和功能。

- 動(dòng)態(tài)灌流：利用Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)灌流功能，模擬體內(nèi)血液循環(huán)和組織間液流動(dòng)，為類器官提供持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和廢物清除。

3. 定期傳代和監(jiān)測(cè)

- 傳代頻率：根據(jù)類器官的生長(zhǎng)情況，定期進(jìn)行傳代，通常每7天進(jìn)行一次。傳代時(shí)，可以使用溫和的細(xì)胞解離試劑，如TrypLE，將類器官分解成較小的片段或單細(xì)胞，然后重新嵌入到新鮮的基質(zhì)中。

- 監(jiān)測(cè)和評(píng)估：定期監(jiān)測(cè)類器官的形態(tài)、細(xì)胞活性和功能?？梢允褂免}黃綠素和碘化丙啶雙染等方法檢測(cè)細(xì)胞活性。此外，通過免疫熒光染色和單細(xì)胞RNA測(cè)序等技術(shù)，評(píng)估類器官中不同細(xì)胞類型的形成和功能。

4. 利用微流控技術(shù)促進(jìn)細(xì)胞間相互作用

- 細(xì)胞間信號(hào)傳遞：通過Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的微流控通道，連接不同的類器官模塊，模擬體內(nèi)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。例如，可以將腸神經(jīng)節(jié)類器官與腸道類器官連接，研究神經(jīng)信號(hào)對(duì)腸道功能的調(diào)控。

- 模擬生理剪切應(yīng)力：利用微流控設(shè)備產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，模擬體內(nèi)腸道的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)類器官的功能成熟。

5. 長(zhǎng)期培養(yǎng)的優(yōu)化

- 冷凍保存：在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，可以將類器官進(jìn)行冷凍保存，以便后續(xù)使用。這有助于保持類器官的基因穩(wěn)定性和功能特性。

- 基因編輯和標(biāo)記：利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9）對(duì)類器官進(jìn)行標(biāo)記或功能改造，以便更好地研究其在長(zhǎng)期培養(yǎng)中的變化。

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