百歐博偉生物：制備高質(zhì)量的單細胞懸液是許多實驗（如流式細胞術(shù)、單細胞測序、原代細胞培養(yǎng)等）的關(guān)鍵步驟。以下是組織單細胞懸液制備的標準流程及注意事項：

一、實驗前準備

1、儀器與耗材

無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子、刀片等）

細胞篩（70 μm、40 μm尼龍濾網(wǎng)）

離心管、培養(yǎng)皿、移液器

恒溫搖床或水浴鍋（37℃）

離心機

2、試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS，含抗生素如青霉素/鏈霉素）

組織消化酶（根據(jù)組織類型選擇）：

膠原酶（Collagenase I/IV，適用于結(jié)締組織）

胰酶（Trypsin，適用于上皮組織）

透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，輔助消化細胞外基質(zhì)）

DNA酶（DNase I，防止DNA導(dǎo)致細胞粘連）

終止液（含血清的培養(yǎng)基或含EDTA的緩沖液）

臺盼藍（檢測細胞活性）

3、組織處理原則

保持低溫操作（冰上處理，減少細胞死亡）。

快速處理新鮮組織（離體后盡快操作）。

二、標準制備流程

1、組織取材與清洗

將組織置于預(yù)冷的PBS中，去除脂肪、血管等非目標組織。

用PBS清洗3次，去除血液和雜質(zhì)。

2、組織剪碎

將組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀剪成1-3 mm3的小塊。

加入少量PBS保持濕潤。

3、酶消化

根據(jù)組織類型選擇消化液（示例）：

實體瘤/堅硬組織：膠原酶IV（1-2 mg/mL）+ DNase I（20 μg/mL）

脾/淋巴結(jié)：膠原酶D + 透明質(zhì)酸酶

上皮組織：胰酶-EDTA

將組織塊浸泡在消化液中，37℃振蕩消化（15-60分鐘，具體時間需預(yù)實驗優(yōu)化）。

每隔10分鐘輕柔吹打一次，加速解離。

4、終止消化

加入含血清的培養(yǎng)基或EDTA緩沖液終止反應(yīng)（血清抑制胰酶活性）。

用移液器反復(fù)吹打組織懸液，直至無明顯大塊組織。

5、過濾與離心

將懸液通過70 μm細胞篩過濾，去除未消化的組織塊。

收集濾液，300-400 ×g 離心5分鐘，棄上清。

用PBS重懸細胞，再次通過40 μm濾網(wǎng)（進一步提高單細胞率）。

6、細胞清洗與重懸

用PBS或培養(yǎng)基洗滌細胞2次，離心去除殘留酶和碎片。

重懸于適量緩沖液中（如PBS + 0.04% BSA）。

7、細胞計數(shù)與活性檢測

臺盼藍染色法：活細胞率需 >85%（若活性低，可優(yōu)化消化時間或酶濃度）。

調(diào)整細胞濃度至目標值（如1×10? cells/mL）。

三、不同組織類型的注意事項

1、實體瘤

可能需要機械輔助（如用注射器反復(fù)吹打或輕柔研磨）。

使用復(fù)合酶（如膠原酶 + 分散酶 Dispase）。

2、脾臟/淋巴結(jié)

可直接機械研磨（用注射器活塞壓碎），無需長時間酶消化。

3、肝臟/腎臟

膠原酶消化后需多次洗滌去除肝細胞碎片。

4、腦組織

使用低濃度胰酶（0.25%）+ DNase，避免過度消化神經(jīng)元。

四、常見問題與解決方案

五、質(zhì)量控制

顯微鏡觀察：確認細胞為單個分散，無明顯團塊或碎片。

流式細胞術(shù)檢測：通過前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）評估細胞均一性。

功能性驗證：根據(jù)后續(xù)實驗（如細胞培養(yǎng)、染色）結(jié)果反向優(yōu)化流程。

通過以上步驟，可高效制備高質(zhì)量單細胞懸液，為下游實驗奠定基礎(chǔ)。不同組織需靈活調(diào)整方案，建議通過預(yù)實驗確定條件。

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