一、背景

小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞是從3T3細(xì)胞（Swissalbino）中經(jīng)克隆分離得到的連續(xù)傳代的亞系。該細(xì)胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態(tài)經(jīng)歷了前脂肪細(xì)胞到脂肪樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。該細(xì)胞鼠痘病毒陰性；可產(chǎn)生甘油三酯，高濃度血清可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。

二、小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

3、輕輕吹打小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

3）小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

三、應(yīng)用

小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞可以用于KRAS對(duì)3T3-L1、C2C12細(xì)胞增殖、自噬和成脂分化的影響：

研究使用si RNA敲降Kras的表達(dá)水平,探究其對(duì)3T3-L1和C2C12細(xì)胞增殖、自噬、成脂分化和脂質(zhì)蓄積的影響及作用機(jī)制。首先,為探究KRAS對(duì)3T3-L1和C2C12細(xì)胞增殖能力的影響,本研究利用si-KRAS抑制KRAS表達(dá)后,通過Ed U和CCK-8方法檢測增殖變化;通過q RT-PCR檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表達(dá)水平的變化。

結(jié)果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細(xì)胞增殖比例(分別為對(duì)照組的0.89±0.07、0.90±0.05倍)以及CCK-8細(xì)胞增殖活力均顯著下降(分別為對(duì)照組的0.82±0.02倍和0.80±0.02倍);增殖相關(guān)基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表達(dá)水平也顯著下降。

隨后,探討了KRAS對(duì)細(xì)胞自噬的影響。在抑制KRAS表達(dá)后,通過免疫熒光染色檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3B的表達(dá)變化;通過Western blot檢測細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3B-II/LC3B-I的表達(dá)變化;通過q RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因Beclin 1和Atg7的m RNA表達(dá)變化。

相關(guān)結(jié)果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細(xì)胞內(nèi)LC3B的熒光強(qiáng)度(分別為對(duì)照組的1.78±0.11倍和1.38±0.04倍)及LC3B-II/LC3B-I的水平顯著增加(分別為對(duì)照組的2.25±0.06倍和1.84±0.14倍),并且,Beclin 1和Atg7的m RNA水平也顯著上升。最后,我們探討了KRAS對(duì)3T3-L1和C2C12細(xì)胞成脂分化的影響及作用機(jī)制。

在敲降KRAS后,本研究通過油紅O(ORO)染色、甘油三酯水平檢測以及成脂相關(guān)基因Dgat1、Scd1、C/ebpβ和Hmgr的m RNA表達(dá)水平檢測明確了KRAS對(duì)成脂分化和脂質(zhì)蓄積的影響;通過Western Blot方法檢測了MAPKs(ERKs、JNKs和p38)、PI3K磷酸化水平的變化;通過分別添加MAPK和PI3K通路的激活劑ANI和740 Y-P,探究KRAS對(duì)3T3-L1和C2C12細(xì)胞成脂的潛在作用機(jī)制。

結(jié)果表明,抑制KRAS表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平(分別為對(duì)照組的1.24±0.02倍、1.24±0.01倍)、ORO OD520值以及Dgat1、Scd1和C/ebpβm RNA表達(dá)水平顯著增加,ERK1/2、JNK1/2/3、p38以及PI3K的磷酸化水平顯著下降。

并且,MAPK通路激活劑ANI可以顯著下調(diào)由抑制KRAS引起的甘油三酯水平的上升,而740 Y-P對(duì)敲降KRAS引起的甘油三酯水平變化則沒有下調(diào)作用,反而進(jìn)一步加強(qiáng)了脂質(zhì)蓄積。

綜上,本研究表明KRAS可以調(diào)控3T3-L1和C2C12細(xì)胞增殖、自噬和成脂分化。研究結(jié)果有助于從分子水平解析脂肪的形成和積累的過程及機(jī)制,從而為調(diào)控肉類營養(yǎng)和成分、提升肉質(zhì)提供了理論依據(jù)。

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