為何穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株成為生物制藥領(lǐng)域的“兵家必爭之地”？

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株被稱為“藥物研發(fā)的基石”，是單克隆抗體、雙抗、疫苗、ADC等生物制品規(guī)?；a(chǎn)的核心環(huán)節(jié)，還是藥物生產(chǎn)成本、效率和質(zhì)量的關(guān)鍵決定因素。一株高產(chǎn)穩(wěn)定的細胞株有可能直接縮短藥物上市周期3-5年。穩(wěn)定細胞株因其穩(wěn)定性高，適用于各種研究應(yīng)用，包括重組蛋白、抗體生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和功能性研究等。

那么，如何打造一株理想的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株呢？

義翹神州在重組表達方面不斷深耕，積累了大量穩(wěn)定株開發(fā)的相關(guān)經(jīng)驗，在提高穩(wěn)定細胞株的生產(chǎn)能力、改善細胞狀態(tài)等方面有著豐富的經(jīng)驗。義翹神州可提供從基因合成到穩(wěn)定細胞株交付的一站式服務(wù)，為客戶的研究提供助力。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建全流程：從載體設(shè)計到單克隆篩選

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株是指在細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達特定基因或者干擾特定基因表達的細胞株。與瞬時轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株便于長期觀察基因?qū)τ诩毎δ艿挠绊懠暗鞍紫嗷プ饔茫绕溥m合于體內(nèi)實驗。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株將外源基因克隆至含有某種篩選標(biāo)記的載體上，將載體轉(zhuǎn)染目的細胞并整合到染色體中，利用載體攜帶的篩選標(biāo)記進行篩選，從而得到可穩(wěn)定表達目的基因的細胞株。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建通常包含：載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、Pool篩選、克隆篩選、PCB建庫、MCB/WCB建庫、細胞株穩(wěn)定性研究等內(nèi)容。

生產(chǎn)用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建首先從表達載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染開始。

首先，轉(zhuǎn)染過程是將表達目的蛋白的基因整合到載體中，再將該載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞內(nèi)。表達水平與基因拷貝數(shù)、基因整合位點的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。常用的轉(zhuǎn)染方式有鈣轉(zhuǎn)、電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等。

常用的宿主細胞是CHO。CHO細胞種類多樣，包括CHO-K1、CHO-S、CH-DG44、CHOZN-GS、CHO-K1SV、CHO-K1SV GS-KO、CHO-K1 GS等。不同的CHO宿主細胞在細胞株構(gòu)建中的表現(xiàn)各異。

接著，采用不同的篩選試劑獲得正確高效表達目的基因的細胞池（Pool）。

為了更高效地篩選出高表達水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，表達載體上除了包含蛋白本身的基因以外，往往還含有各種篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記一般可以被分為兩大類：一類是以G418為代表的抗生素類篩選標(biāo)記；另一類是以MTX為代表的細胞代謝篩選標(biāo)記。

不同種類的篩選標(biāo)記（源自文獻：DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720）

當(dāng)目的基因被轉(zhuǎn)染到宿主細胞內(nèi)，按照一定的細胞密度在合適的篩選壓力下進行傳代培養(yǎng)后便可獲得細胞池（Pool）。針對不同的宿主細胞可以采取不同的Pool篩選方式。例如：采用搖瓶進行大規(guī)模Pool篩選，或采用孔板進行迷你Pool篩選。Pool的表達量取決于轉(zhuǎn)染的方式、篩選壓力以及目的基因整合情況。

對于不同的目的蛋白分子，在Pool階段需要考察的標(biāo)準(zhǔn)不同。例如：對于常規(guī)新藥抗體，往往表達量為第-一評價標(biāo)準(zhǔn)；對于生物類似物，在Pool階段則需著重考察各項質(zhì)量參數(shù)與原研藥的差異；對于雙特異性抗體，在此階段需開始考察正確裝配的比例，以期降低克隆篩選階段的風(fēng)險。

細胞池Pool中的每個細胞特性各異，具有不同的基因整合位點、拷貝數(shù)、生長速率等，因此需將其中具有高產(chǎn)、穩(wěn)定表達特性的細胞個體分離出來分別加以富集培養(yǎng)，獲得數(shù)百甚至上千的候選克隆供進一步篩選。

最后，單克隆篩選是關(guān)鍵操作步驟。

通常采用以下組合形式篩選單克隆，確保單個細胞形成單克?。?/span>

義翹神州穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)

義翹神州擁有流式細胞儀、Beacon®單細胞光導(dǎo)系統(tǒng)等儀器設(shè)備，歡迎大家咨詢探討相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株單克隆篩選方案。同時，義翹神州擁有GS系統(tǒng)和可用于藥品申報的整套系統(tǒng)，能夠完成各類穩(wěn)定細胞株的開發(fā)篩選工作。

免責(zé)聲明：義翹神州內(nèi)容團隊僅是分享和解讀公開的研究論文及其發(fā)現(xiàn)，專注于介紹生物醫(yī)藥研究新進展。本文僅作信息交流用，文中觀點不代表義翹神州立場。隨著對疾病機制研究的深入，新的實驗結(jié)果或結(jié)論可能會修改文中的描述，還請大家理解。

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【參考文獻】

1.  Feng Li, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody production. mAbs, 2010. DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720

2. Noh, et al. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep, 2018. doi.org/10.1038s41598-018-23720-9