血漿中C5a的ELISA測(cè)定

• 實(shí)驗(yàn)原理

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• 將抗C5a單克隆抗體包被固相聚苯乙烯板，加入經(jīng)聚乙二醇(PEG)處理的待測(cè)樣本，然后依次加入兔抗人C5a-IgC多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IsC，再加入底物2，2’-連氮-雙(3-乙基苯駢唑啉-6-磺酸鹽)(ABTS)和H2O2顯色，于酶標(biāo)儀405mn處測(cè)定每分鐘光密度增加量(OD/min)，以O(shè)D/min為縱坐標(biāo)，C5a標(biāo)準(zhǔn)晶濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求出待測(cè)樣本中C5a的含量。

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• 實(shí)驗(yàn)試劑

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• 1. PBSPH7.2，9mmol/L磷酸鹽緩沖液含140mmol/L NaCl。

• 2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05％Tween20，簡(jiǎn)稱PBS-T。

• 3. 底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸鈉，50mmol/L磷酸鈉，2.5mmol/L H2O2。

• 4. 沉淀劑：①：100mL pH8.0，20mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀劑②：100mLpH2.0.100mmol／L甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG4000。

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• 實(shí)驗(yàn)步驟

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• 1. 用鹽和/或PEG沉淀血漿中C5：在微量反應(yīng)板中加入EDTA抗凝血漿100gL，然后加人100/uL沉淀劑，用下述三種方法中任何一種沉淀血漿中C5。

• 1) 在微量反應(yīng)板中加入100uL 2mol/L HCl與100uL EDTA抗凝血漿混合，室溫5h。加入HCl后血漿pH值在1.0-1.5之間。上清用4倍體積的0.29mol/L Tris調(diào)節(jié)至pH7.1-7.4。

• 2) 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑①，室溫30min。

• 3) 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑②(血漿pH值在4.0-4.5之間)。室溫30min。用方法2)和方法3)沉淀C5后，上清加入4倍體積的含0.05％Tween 20 pH7，10.21mol/L Tris-HCl緩沖液，血漿被稀釋10倍。

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• 2. 用抗C5a單克隆抗體(McAb)包被酶標(biāo)反應(yīng)板：用pHl0.6，50mmol/L碳酸鈉溶液將抗C5aMcAb稀釋成10ug/mL，每孔加100uL，4℃ 16h。次日取出每孔加含1％(W/V)明膠的PBSl50gL，室溫lmin；然后用PBS-Tween 20洗滌一次。

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• 3. 樣本中CSa的檢測(cè)：

• 洗滌后的酶標(biāo)板，每孔加入方法1)、2)或3)處理的血漿樣本zoot&，4℃16h，用PBS-Tween20洗滌1次，每孔加入用含0．1％明膠的PBS-T稀釋的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗體(46ug/mL)100t&，室溫2h，用PBS-Tween20洗滌3次；每孔加入用含0.1％明膠PBS-T稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IgClOOt&(稀釋前l(fā)mL過氧化物酶偶聯(lián)物內(nèi)加100ul無(wú)關(guān)鼠McAb、10ul人血漿或10ul激活的人血清處理)，室溫2min，每孔用PBS-Tween20洗滌4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T調(diào)零，每3min于酶標(biāo)儀405nm處讀取OD值。以O(shè)D/min增加量計(jì)算過氧化物酶活性。其活性與血漿中C5a含量呈正相關(guān)。本法檢測(cè)極限為1ng/mL，此法未檢測(cè)出正常人新鮮血漿中的C5a。

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• 4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取已知濃度純化的C5a，對(duì)倍稀釋成一系列不同的濃度(0.039-5.000ng/mL)，分別加入包被有抗C5aMcAb的酶標(biāo)板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C5a-IgC和過氧化物酶偶聯(lián)的豬抗兔IgC及過氧化物酶的底物，以PBS-Tween調(diào)零點(diǎn)，讀取OD40s/min增加量，以C5a(desarg)濃度為橫坐標(biāo)，OD40s/minx 200為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)取6個(gè)已知濃度的純化C5a。