細(xì)胞凍存

細(xì)胞生物學(xué)研究中，為了更好而長期地研究細(xì)胞生物學(xué)功能，需要將良好狀態(tài)的細(xì)胞保存起來，以備將來使用。

在不附加任何保護劑下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在負(fù) 130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞凍存時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，待復(fù)蘇時重新進入生長分裂周期。

一、實驗前準(zhǔn)備

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30 分鐘。采用通風(fēng)機通風(fēng) 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。

將離心機調(diào)節(jié)至 800 轉(zhuǎn)，5 分鐘。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細(xì)胞完全培養(yǎng)基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中預(yù)熱。

首先消毒雙手和超凈臺。取約 10 毫升細(xì)胞完全培養(yǎng)基放于 15 毫升離心管中。

配置細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞，按無血清培養(yǎng)基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細(xì)胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分后，輕輕吸打混勻，置于室溫下待用。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，進行瓶口消毒，棄去細(xì)胞原來的培養(yǎng)基。按每 25 平方厘米1 毫升胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入兩毫升細(xì)胞完全培養(yǎng)基以立即終止消化。

采用無菌槍頭輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的 15 毫升離心管內(nèi)。

配平離心：采用天平配平兩端，每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5 分鐘。

三、細(xì)胞計數(shù)

采用羅氏 CASY-DT 快速細(xì)胞計數(shù)及活率分析儀進行細(xì)胞計數(shù)。加入 10 毫升 CASY-ton至以標(biāo)記 viable 的管子中，加入 100 微升細(xì)胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細(xì)胞計數(shù)?？梢娒亢辽龖乙褐杏谢罴?xì)胞總數(shù)。

四、細(xì)胞凍存

取出凍存管，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。

離心后，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為每毫升有 5 乘 10 的五次方為宜。

將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般一個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細(xì)胞凍

存懸液為宜。

嚴(yán)密封口后，進行程序性降溫凍存：

首先 4 度 30 分鐘，負(fù) 20 度 30 分鐘，負(fù) 80 度過夜，最后進行液氮保存。

另有一種比較實用的降溫方法：用最少兩厘米厚的醫(yī)用棉紗將凍存管緊緊包裹，扎緊，直接放入-70 度冰箱，隔夜取出凍存管直接放液氮凍存。或直接采用程序性降溫盒更為方便。

五、注意事項

1、細(xì)胞活力及濃度

細(xì)胞應(yīng)在生長良好、致密度約為 80-90％、數(shù)目一般為 106 -107 /ml，活力達 90%以上的狀態(tài)下凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時期凍

存。

2、注意冷凍保護劑之品質(zhì)

DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，可以用 0.22 微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產(chǎn)品。以 5-10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

使用 DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保存效果。在常溫下，DMSO 對人體有害，故在配制時最好帶上手套?；靹?DMSO 要快，因為 DMSO 對細(xì)胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。尤為值得注意的是細(xì)胞中加入凍存液后，一定要混勻，防止 DMSO 沉淀。

3、提前配制凍存液

凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞。

4、實行細(xì)胞慢凍的原則

緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞損害。對于大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1-3℃是合適的。相反，若不緩慢冷凍，造成的結(jié)晶就大，大結(jié)晶會引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

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