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微生物發(fā)酵研究新方案:自動(dòng)化與高通量的結(jié)合

來源:哈美頓(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司   2025年05月08日 16:00  

在微生物發(fā)酵研究領(lǐng)域,如何快速、高效地獲取微生物在不同條件下的基因表達(dá)信息,一直是科研人員關(guān)注的重點(diǎn)。今天要給大家介紹一項(xiàng)刊登于Microorganisms的研究,它通過自動(dòng)化液體工作站,將RNA-Seq樣本制備與微型平行生物反應(yīng)器相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了高通量的差異基因表達(dá)研究,為生物過程開發(fā)帶來了新的思路和方法。

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研究背景

生物過程開發(fā)中,確定生產(chǎn)菌株的最佳培養(yǎng)條件十分關(guān)鍵。平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)結(jié)合自動(dòng)化和微型化方法,能加速這一進(jìn)程。而RNA-Seq技術(shù)可從分子層面了解微生物生產(chǎn)菌株,但此前自動(dòng)化、高通量的批量RNA-Seq設(shè)置尚未見報(bào)道。本研究旨在填補(bǔ)這一空白,利用釀酒酵母,在微型平行攪拌罐生物反應(yīng)器中,結(jié)合自動(dòng)化RNA-Seq樣本制備流程,研究不同碳源對(duì)其基因表達(dá)的影響。

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實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基:使用野生型釀酒酵母菌株(DSM No. 1333),菌種培養(yǎng)基于YPD培養(yǎng)基,平行攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)使用特定成分的培養(yǎng)基,添加抗生素防止污染。


2. 平行攪拌罐生物反應(yīng)器:采用24攪拌罐生物反應(yīng)器單元,工作體積11mL,集成到液體處理系統(tǒng)中,該系統(tǒng)配備多種功能模塊,可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。溫度、pH、溶解氧等參數(shù)精準(zhǔn)控制,還能定期采樣進(jìn)行光密度(OD600)測(cè)量。


3. 自動(dòng)化RNA-Seq樣本制備流程:基于液體處理站(LHS)開發(fā)并優(yōu)化了24個(gè)反應(yīng)器的自動(dòng)化RNA-Seq樣本制備流程。當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)的攪拌罐反應(yīng)器平均OD600超過2.5時(shí),觸發(fā)樣本制備流程。流程包括酶解細(xì)胞裂解、總RNA提取、核酸濃度歸一化和cDNA文庫制備,且與發(fā)酵過程并行進(jìn)行。其中,RNA提取使用特定試劑盒,cDNA文庫制備自動(dòng)化完成,不過樣本收集、移液器吸頭補(bǔ)充以及最終的文庫定量和上樣等步驟需手動(dòng)操作。


4. RNA-Seq數(shù)據(jù)分析:測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)一系列軟件處理,包括堿基識(shí)別、讀長(zhǎng)篩選、與參考轉(zhuǎn)錄組比對(duì)等。通過tximport匯總蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本,使用edgeR進(jìn)行差異基因表達(dá)分析,以特定閾值篩選差異表達(dá)基因,最后用clusterProfiler進(jìn)行基因集富集分析。


實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì):自動(dòng)化液體工作站的關(guān)鍵作用

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  1. 高通量與高效性:自動(dòng)化液體工作站能同時(shí)操作24個(gè)平行生物反應(yīng)器,11.5小時(shí)內(nèi)完成24個(gè)樣本的RNA提取和cDNA文庫制備,大大提高了實(shí)驗(yàn)通量,相比傳統(tǒng)方法節(jié)省大量時(shí)間。讓科研人員能夠在更短的時(shí)間內(nèi)獲取大量寶貴數(shù)據(jù)。

  2. 精準(zhǔn)操作與穩(wěn)定運(yùn)行:液體工作站配備多種功能模塊,可精準(zhǔn)控制實(shí)驗(yàn)條件,Hamilton配置的生物反應(yīng)器可以精準(zhǔn)設(shè)置控制如溫度、攪拌速度、pH等實(shí)驗(yàn)條件。在樣本制備過程中,對(duì)不同體積試劑的移液操作也能保證較高的準(zhǔn)確性和精度,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

  3. 實(shí)現(xiàn)流程整合:它將發(fā)酵過程與RNA-Seq樣本制備流程整合在同一平臺(tái),避免了樣本轉(zhuǎn)移帶來的誤差和污染風(fēng)險(xiǎn),還能及時(shí)處理RNA樣本,減少細(xì)胞過程變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。一個(gè)功能完備的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。工作站上配備的多種功能模塊,從試劑添加、樣本混合到反應(yīng)條件控制,都能一站式完成。這種高度集成化的設(shè)計(jì),不僅節(jié)省了實(shí)驗(yàn)空間,還大大提高了實(shí)驗(yàn)操作的便捷性和連貫性,讓科研人員能夠更專注于實(shí)驗(yàn)核心環(huán)節(jié)。這也歸功于BioReactor生物反應(yīng)器的小巧以及工作站可整合性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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  1. 不同碳源下的生長(zhǎng)情況:釀酒酵母在不同碳源下生長(zhǎng)模式各異。葡萄糖、果糖和蔗糖為碳源時(shí),前期呈指數(shù)增長(zhǎng),耗盡后利用乙醇繼續(xù)生長(zhǎng);半乳糖和甘露糖為碳源時(shí),延遲期長(zhǎng)且生長(zhǎng)緩慢;丙酮酸為碳源時(shí),生長(zhǎng)受限。

  2. RNA和cDNA濃度:RNA提取后,不同樣本RNA產(chǎn)量有差異,丙酮酸培養(yǎng)的樣本RNA產(chǎn)量顯著較低,葡萄糖培養(yǎng)的樣本RNA產(chǎn)量較高。cDNA產(chǎn)量在不同生物重復(fù)間差異較大,主要受低體積試劑移液準(zhǔn)確性影響。

  3. 測(cè)序結(jié)果與差異基因表達(dá)分析:測(cè)序得到大量高質(zhì)量讀長(zhǎng),經(jīng)篩選和比對(duì),確定了不同條件下的差異表達(dá)基因。如葡萄糖與丙酮酸比較,有大量差異表達(dá)基因,涉及多種代謝途徑;葡萄糖與果糖比較,差異表達(dá)基因較少,這與預(yù)期細(xì)胞反應(yīng)相符。

研究展望

本研究建立的高通量實(shí)驗(yàn)方法為生物反應(yīng)器培養(yǎng)的分子水平評(píng)估提供了有效手段,但仍有改進(jìn)空間。后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化液體類開發(fā),采用例如Hamilton Magpip移液通道,提高通量減少試劑耗材成本;還可拓展該方法,使其適用于更多微生物,推動(dòng)生物過程開發(fā)的發(fā)展。

這項(xiàng)研究借助自動(dòng)化液體工作站,為微生物發(fā)酵研究帶來了新突破。相信在未來,隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化和完善,它將在生物工程領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用,助力科研人員探索更多生命奧秘。

關(guān)于Hamilton生物反應(yīng)器

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Bioreactor是基于Hamilton STAR液體處理平臺(tái)與2mag合作設(shè)計(jì)開發(fā)的生物反應(yīng)器。在一個(gè)非常緊湊的空間里,多達(dá)48個(gè)生物反應(yīng)器可并行運(yùn)行,并根據(jù)需要進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)料、pH調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)和采樣。與STAR液體處理工作站無縫集成,高氧氣傳輸率和功率輸入可與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器相媲美。


參考文獻(xiàn)

[1] Blums, K., Herzog, J., Costa, J., Quirico, L., Turber, J., & Weuster-Botz, D. (2025). Automation of RNA-Seq Sample Preparation and Miniaturized Parallel Bioreactors Enable High-Throughput Differential Gene Expression Studies. Microorganisms,13(4),849. 


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