Brain regulates weight bearing bone through PGE2 skeletal interoception: implication of ankle osteoarthritis and pain

Subject terms: Bone, Pathogenesis

內(nèi)感受（Interoception）是一種監(jiān)測生物體內(nèi)部狀態(tài)，調(diào)節(jié)大腦和外周器官之間復(fù)雜相互作用的大腦回路。下丘腦通過下行神經(jīng)或神經(jīng)內(nèi)分泌通路整合外周信息和協(xié)調(diào)外周器官來控制全身穩(wěn)態(tài)。研究表明，骨骼內(nèi)感受（Skeletal Interoception）調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。感覺神經(jīng)被骨骼中的前列腺素E2（PGE2）激活，誘導(dǎo)下丘腦中 cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的磷酸化作為上行內(nèi)感受信號，該信號進一步下調(diào)交感神經(jīng)活動并促進成骨。重要的是，骨骼內(nèi)感受信號還下調(diào)下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）表達，以誘導(dǎo)脂肪組織脂肪分解，促進成骨形成。

PGE2 被認為是骨骼生長的有效合成代謝調(diào)節(jié)劑。負荷骨組織中 PGE2 水平增加，直接給藥導(dǎo)致骨形成。PGE2 還增加了骨骼對機械負荷的敏感性。前列腺素的生化阻塞導(dǎo)致骨骼無法感知和響應(yīng)機械刺激。此外，暴露于流體剪切的成骨細胞增加了環(huán)氧合酶-2（COX2）的表達，而COX2 是負責 PGE2 合成的酶。因此，PGE2 可以作為機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，通過骨骼內(nèi)感受將外部機械負荷信號轉(zhuǎn)化為生化反應(yīng)。然而，目前尚不清楚從骨細胞響應(yīng)機械應(yīng)力而產(chǎn)生的信號是否在大腦中被處理和解釋以調(diào)節(jié)骨重塑以維持其機械結(jié)構(gòu)和新陳代謝，以及這在疾病期間如何變化。

基于此，美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院骨外科曹旭教授團隊在 Bone Research 期刊在線發(fā)表了題為“Brain regulates weight bearing bone through PGE2 skeletal interoception: implication of ankle osteoarthritis and pain”的研究成果。這項研究調(diào)查了響應(yīng)機械應(yīng)力的 PGE2 骨骼內(nèi)感受是否在正常生理期間被處理以及大腦是如何解釋該信號的。研究數(shù)據(jù)表明，在響應(yīng)機械負荷時，骨骼內(nèi)感受以下丘腦處理 PGE2 驅(qū)動的外周信號的形式發(fā)生，以維持生理性骨穩(wěn)態(tài)，而慢性升高的 PGE2 可以在踝骨性關(guān)節(jié)炎（AOA）期間被感知為疼痛，而這暗示了潛在的治療方案。

機械負荷刺激骨骼系統(tǒng)中 PGE2 水平的增加。通過測量不同位置骨骼中 PGE2 水平，研究人員發(fā)現(xiàn)，骨骼每個部位的 PGE2 濃度與其負重程度成正比。

COX2是 PGE2 的關(guān)鍵限速生物合成酶，因此檢測了COX2是否介導(dǎo)骨形成。研究發(fā)現(xiàn)，距骨中COX2的表達明顯高于脛骨和跟骨（圖1 a）。值得注意的是，距骨中幾乎沒有 TRAP 染色，而成年小鼠的脛骨和跟骨則有相對較強的染色（圖1 b），這與每個骨表面的破骨細胞數(shù)量（N.Oc/BS）和骨髓中破骨細胞密度的顯著差異相關(guān)（圖1 c、d）。組織蛋白酶K（CTSK）由破骨細胞高度表達和分泌，是其骨吸收活性所必需的，也在骨細胞中表達（圖1 f）。此外，跟骨和脛骨中觀察到相當數(shù)量的穩(wěn)態(tài) CTSK+ 破骨細胞，但在距骨中沒有觀察到（圖1 e、g），而免疫組化顯示距骨、跟骨和脛骨中的 CTSK+ 骨細胞處于穩(wěn)態(tài)（圖1 f、h）。這些結(jié)果可能表明，骨細胞中的 CTSK 調(diào)節(jié)距骨表面重塑。這些發(fā)現(xiàn)證明，在生理條件下，距骨中的 PGE2 介導(dǎo)獨立于破骨細胞的骨重塑。

已知 PGE2 可刺激成骨細胞骨形成。因此，測量了脛骨軸向壓縮（2Hz，2N-12N）后骨髓中的 PGE2 水平，發(fā)現(xiàn)其在加載后 3 小時和 6 小時增加，在 12 小時后下降到正常水平（圖1 i）。免疫組織化學分析還發(fā)現(xiàn)，與非負荷對照相比，負荷后脛骨小梁表面的 COX2 表達更高（圖1 j）。通過 μCT 分析，發(fā)現(xiàn)在負荷 1 個月后，骨形成的程度顯著增加（圖1 l、m）。

為了進一步檢查 PGE2 是否主要由成骨細胞響應(yīng)機械負荷分泌，在小鼠成骨細胞中敲除 COX2 以消除成骨細胞分泌的 PGE2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGE2 濃度在加載后12小時內(nèi)未發(fā)生變化，這表明 PGE2 主要由成骨細胞分泌（圖1 k）。此外，未發(fā)現(xiàn)機械加載后骨形成的增加（圖1 n、o）。這些數(shù)據(jù)表明，骨骼中的 PGE2 濃度隨著機械負荷的增加而增加，機械負荷通過上調(diào) PGE2 水平促進骨形成。

圖1     PGE2 介導(dǎo)機械負荷誘導(dǎo)的成骨細胞骨形成。

為了研究感覺神經(jīng)在距骨穩(wěn)態(tài)中的作用，生成了感覺神經(jīng) TrkA 缺失小鼠，發(fā)現(xiàn) TrkA 的缺失減少了距骨骨形成，表明感覺神經(jīng)功能對成人距骨穩(wěn)態(tài)起著重要作用。接下來，測試了感覺神經(jīng)中 TrkA 的缺失是否可以減少機械負荷誘導(dǎo)的骨形成。對 TrkAwt 和 TrkAAvil?/? 小鼠施加一個月的脛骨軸向壓縮，發(fā)現(xiàn) TrkAw小鼠，與非負荷對照相比，機械負荷顯著增加了脛骨骨形成，TrkAAvil–/– 小鼠中負荷誘導(dǎo)的骨形成被消除。此外，與非負荷對照相比，機械加載后野生型小鼠的 Ocn+ 成骨細胞顯著增加，而 TrkAAvil–/– 小鼠中則沒有。這些結(jié)果表明，外周感覺神經(jīng)調(diào)節(jié)負荷誘導(dǎo)的成骨。

EP4 是 PGE2 的關(guān)鍵受體，該信號通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動來維持成年小鼠成骨和脂肪生成的平衡。為了確定機械負荷誘導(dǎo)的骨形成是否由感覺神經(jīng)中的 PGE2-EP4 信號介導(dǎo)，生成了特異性 EP4 敲除小鼠（EP4Avil–/–），發(fā)現(xiàn)與對照組相比，EP4wt 小鼠機械負荷后骨量顯著增加，然而，這種效果在EP4Avil–/– 小鼠中減弱（圖2 a）。同樣，免疫染色發(fā)現(xiàn)，與非負荷對照相比，EP4wt 小鼠中機械負荷與顯著增加的 Ocn+ 成骨細胞數(shù)量相關(guān)，而這些影響在EP4Avil–/– 小鼠中不存在（圖2 b）。

成骨細胞衍生的 PGE2 介導(dǎo)的EP4 受體激活通過下丘腦 CREB 信號抑制交感神經(jīng)活動來促進骨形成。通過對下丘腦切片進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)與非負荷對照組相比，機械負荷與下丘腦弓狀核（ARC）中磷酸化 CREB（pCREB）水平顯著升高相關(guān)（圖2 c）。相比之下，機械負荷后，COX2Ocn?/? 小鼠中的pCREB水平并不比 COX2wt小鼠高（圖2 d）。這些數(shù)據(jù)進一步表明，成骨細胞在機械負荷下分泌 PGE2 以激活骨骼內(nèi)感受。此外，在EP4Avil–/– 小鼠中，與 EP4wt 小鼠相比，機械負荷后 pCREB 水平并不高（圖2 e），表明機械負荷可能通過激活 PGE2-EP4 上行內(nèi)感受通路來刺激骨形成。

為了評估交感神經(jīng)活動，對下丘腦室旁核（PVN）中的酪氨酸羥化酶（TH）進行了免疫染色，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，機械負荷組的 TH 表達顯著降低（圖2 f）。正如預(yù)期的那樣，機械負荷與 EP4wt 小鼠而非EP4Avil–/– 小鼠中較低的 TH 表達相關(guān)（圖2 g）。這些發(fā)現(xiàn)表明，響應(yīng)機械負荷的骨骼內(nèi)感受是由 ARC 中的 CREB 磷酸化誘導(dǎo)的，其抑制 PVN 中的 TH 表達以促進成骨。

圖2    機械負荷通過 PGE2/EP4 內(nèi)感受信號誘導(dǎo)成骨。

ARC 是控制能量平衡和自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要部位，PVN 已被確定為有助于控制交感神經(jīng)輸出和能量消耗的主要下丘腦部位。驗證ARC-PVN 神經(jīng)回路控制能量平衡，數(shù)據(jù)表明 ARC 神經(jīng)元投射到 PVN。重要的是，與非負荷對照組相比，機械負荷與 ARC 中 CTB 標記神經(jīng)元中 pCREB 的表達顯著增加相關(guān)。這表明，ARC-PVN 回路參與機械負荷誘導(dǎo)的骨骼內(nèi)感受。此外，在機械負荷期間，與左腦對照相比，右腦 AgRP+ 神經(jīng)元的抑制與ARC中pCREB表達的顯著降低有關(guān)。重要的是，與對照（左）側(cè)相比，ARC 中 AAV 注射側(cè)（右側(cè)）在機械加載后 PVN 中 TH 表達的抑制被消除。這些結(jié)果表明，機械負荷激活 ARC-PVN 回路以降低交感神經(jīng)活動。

由 Crem 基因編碼的 CREM 是 CRE 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑。Crem 基因以其產(chǎn)生多種選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄物變體而著稱，包括 CREMτ、CREMα、CREMβ、CREMγ 和 ICER，每個變體具有不同的功能。為了確定機械負荷是否增加下丘腦中 CREM 的表達以調(diào)節(jié) Th 基因表達，通過RT-PCR 測量了機械負荷后小鼠 PVN 中 Crem mRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)與非負荷對照組相比，負荷小鼠的 Crem mRNA 表達顯著升高（圖3 a），其中轉(zhuǎn)錄抑制性 CREMα、β 和 γ，而非轉(zhuǎn)錄激活性 CREMτ，的表達水平更高（圖3 b-d）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，機械負荷誘導(dǎo) CREM 與 Th 啟動子的 CRE 結(jié)合位點特異性結(jié)合（圖3 e、f）。此外，通過對下丘腦切片進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)機械負荷的EP4wt 小鼠中PVN 中 CREM 的表達顯著增加，且這種效應(yīng)在 EP4Avil–/– 小鼠中急劇減少（圖3 g）。這些結(jié)果表明，機械負荷通過 ARC-PVN 回路激活 PGE2-EP4 介導(dǎo)的骨骼內(nèi)感受信號，以誘導(dǎo) PVN 中的 CREM 表達以抑制 TH 表達，從而抑制交感神經(jīng)驅(qū)動。

磷酸化的 STAT3（p-STAT3）作為轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合并調(diào)節(jié)靶基因的表達，以調(diào)節(jié)能量代謝。研究發(fā)現(xiàn)，機械負荷在 EP4wt小鼠PVN 中誘導(dǎo)了更高水平的 p-STAT3（圖3 h），且 pSTAT3 與啟動子特異性結(jié)合（圖3 i、g）。此外，通過對下丘腦切片進行免疫染色，發(fā)現(xiàn) pSTAT3 的表達在負荷的 EP4wt小鼠的 PVN 中顯著升高，且這種效應(yīng)在 EP4Avil–/– 小鼠中明顯減弱（圖3 h）。這些數(shù)據(jù)表明，機械負荷激活 PGE2-EP4 介導(dǎo)的骨骼內(nèi)感受通路，誘導(dǎo) PVN pSTAT3 信號的激活，從而刺激 CREM 的合成。

圖3    機械負荷通過 PGE2/EP4 內(nèi)感受通路抑制通過 ARC → PVN 回路的交感神經(jīng)活動。

最后，研究測試了感覺神經(jīng)支配是否由 PGE2 啟動并與 AOA 相關(guān)疼痛相關(guān)。建立AOA 和踝關(guān)節(jié)疼痛的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在 12 周齡 AOA 小鼠中，骨髓（BV/TV）和骨小梁參數(shù)均顯著降低（圖4 a、b），距骨腔周圍有綠色染色的骨基質(zhì)（圖4 c），表明手術(shù)后 8 周距下關(guān)節(jié)明顯退變。此外，野生型小鼠AOA術(shù)后2個月右后爪同側(cè)強度百分比和兩肢接觸面積（圖4 d、e）與假手術(shù)對照組相比存在顯著差異。AOA 中骨細胞中 COX2 的表達高于假手術(shù)對照（圖4 f）。重要的是，AOA 小鼠的 CGRP+ 神經(jīng)絲密度和距骨中的 PGE2 水平明顯高于假手術(shù)組（圖4 h、g），表明手術(shù)會導(dǎo)致機械負荷增加，進而導(dǎo)致 PGE2 水平升高。此外，與假手術(shù)小鼠相比，AOA 小鼠骨細胞中 CTSK 的表達顯著增加（圖4 i），表明 CTSK 活性與距骨中的 CGRP+ 感覺神經(jīng)支配有關(guān)。

為了進一步檢驗在人類疾病中的假設(shè)，從接受全踝關(guān)節(jié)置換術(shù)（TAA）的終末期 AOA 患者中收集手術(shù)樣本（圖4 j），與健康距骨相比，其骨量明顯減少（圖4 k、l）。健康對照和距骨中的 AOA 樣本之間的 TRAP+ 破骨細胞表達沒有差異（圖4 m）。重要的是，與健康距骨相比，AOA 樣本中骨細胞中 COX2 的表達顯著更高（圖4 n）。此外，觀察到與健康對照相比，AOA 樣本 8 周后距骨軟骨中的 CTSK 表達顯著增加（圖4 o），CGRP+ 感覺神經(jīng)纖維也更多（圖4 p）。這些結(jié)果表明，PGE2 升高與通過感覺神經(jīng)誘導(dǎo)的 AOA 相關(guān)疼痛有關(guān)。

圖4    PGE2 水平的改變導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎和感覺神經(jīng)疼痛。

圖5   圖形概要

總之，該研究結(jié)果表明，下丘腦通過感知響應(yīng)機械負荷而升高的骨 PGE2 濃度來調(diào)節(jié)骨骼重塑和結(jié)構(gòu)。機械負荷促進 PGE2/EP4-ARC-PVN 骨骼內(nèi)感受上行通路，從骨骼到大腦下調(diào)交感神經(jīng)張力信號以進行骨骼重塑。PGE2 上行內(nèi)感受信號調(diào)節(jié)下丘腦酪氨酸羥化酶活性以維持負重骨穩(wěn)態(tài)。如果負荷異常，尤其是在 AOA 中，則可能導(dǎo)致慢性疼痛，并對潛在的治療產(chǎn)生影響。

參考文獻：Gao F, Hu Q, Chen W, Li J, Qi C, Yan Y, Qian C, Wan M, Ficke J, Zheng J, Cao X. Brain regulates weight bearing bone through PGE2 skeletal interoception: implication of ankle osteoarthritis and pain. Bone Res. 2024 Mar 5;12(1):16. doi: 10.1038/s41413-024-00316-w. PMID: 38443372; PMCID: PMC10914853.

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