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一、流式細(xì)胞儀技術(shù)原理
流式細(xì)胞儀是一種能夠分離、鑒定和計數(shù)以單細(xì)胞液體流形式穿過激光束的細(xì)胞的高科技設(shè)備。其工作原理主要基于以下幾個關(guān)鍵點(diǎn)：
流體動力學(xué)聚焦原理：
細(xì)胞樣本需制成單細(xì)胞懸液。
在流式細(xì)胞儀的流動室中，細(xì)胞被鞘液包圍，通過精確控制鞘液和樣本流的流速與壓力，使細(xì)胞在鞘液裹挾下呈單列依次通過檢測區(qū)域。這樣確保每個細(xì)胞能被單獨(dú)檢測，避免細(xì)胞之間的干擾。
激光激發(fā)原理：
當(dāng)細(xì)胞逐個通過檢測區(qū)時，激光束照射細(xì)胞。
若細(xì)胞中的成分被熒光染料標(biāo)記，就會吸收激光能量。不同熒光染料因化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，有不同激發(fā)和發(fā)射波長。特定染料與細(xì)胞內(nèi)核酸結(jié)合后，在激光照射下會產(chǎn)生熒光。
熒光檢測原理：
被激發(fā)的熒光信號由光學(xué)系統(tǒng)收集，其中濾光片可篩選特定波長熒光。
光電探測器將熒光信號轉(zhuǎn)變成電信號，電信號強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比。
通過分析電信號，可獲取細(xì)胞大小(依據(jù)前向散射光，細(xì)胞越大，前向散射光越強(qiáng))、內(nèi)部復(fù)雜程度(依據(jù)側(cè)向散射光)以及熒光標(biāo)記所代表的生物學(xué)特性(如細(xì)胞表面抗原表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、DNA含量等)等信息。
二、流式細(xì)胞儀操作流程
流式細(xì)胞儀的操作流程包括樣本制備、儀器校準(zhǔn)、樣本檢測、數(shù)據(jù)分析等步驟，具體如下：
樣本制備：
獲取細(xì)胞樣本，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x合適熒光染料染色細(xì)胞。血液樣本需抗凝處理，可用EDTA抗凝管并稀釋或用密度梯度離心分離特定細(xì)胞群。組織樣本則要機(jī)械破碎或酶消化成單細(xì)胞懸液。
注意染色的溫度和時間條件，特定抗體染色需在合適溫度下孵育一定時間。
儀器校準(zhǔn)：
在檢測前，要調(diào)節(jié)激光功率、校準(zhǔn)光路，確保激光準(zhǔn)確照射檢測區(qū)域。
設(shè)置光電倍增管電壓以優(yōu)化熒光信號檢測范圍。
設(shè)置閾值以排除細(xì)胞碎片等干擾，根據(jù)細(xì)胞大小設(shè)前向散射光閾值，小于一定大小的顆粒信號被排除。
樣本檢測：
將制備好的樣本放于流式細(xì)胞儀樣本架，啟動程序。
細(xì)胞在流體動力學(xué)聚焦下通過檢測區(qū)，產(chǎn)生的熒光和散射光信號被檢測收集。檢測中可在顯示屏實(shí)時觀察信號變化。
數(shù)據(jù)分析：
檢測完成后，用專門軟件處理數(shù)據(jù)。
可根據(jù)熒光信號強(qiáng)度和分布對細(xì)胞分類計數(shù)，如繪制熒光強(qiáng)度直方圖顯示不同強(qiáng)度細(xì)胞比例。
也可進(jìn)行雙參數(shù)或多參數(shù)分析，如用散點(diǎn)圖展示兩種抗原表達(dá)水平的細(xì)胞分布。
三、注意事項與維護(hù)保養(yǎng)
注意事項：
樣本制備時需確保細(xì)胞懸液的均勻性和分散性，避免細(xì)胞團(tuán)聚或沉淀。
儀器校準(zhǔn)需定期進(jìn)行，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
在檢測過程中，需注意觀察信號變化，及時發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。
維護(hù)保養(yǎng)：
定期清潔流式細(xì)胞儀的流動室、激光器等部件，避免污染和堵塞。
定期檢查并更換濾光片、光電倍增管等易損件，確保儀器性能良好。
定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
綜上所述，流式細(xì)胞儀是一種基于流體動力學(xué)聚焦、激光激發(fā)和熒光檢測原理的高科技設(shè)備。其操作流程包括樣本制備、儀器校準(zhǔn)、樣本檢測和數(shù)據(jù)分析等步驟。在使用過程中，需注意樣本制備的均勻性和分散性、儀器校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性以及檢測過程中的信號變化。同時，還需定期對儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，以確保其性能良好和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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