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真菌菌種保存全攻略:方法、步驟與注意事項

來源:廣東環(huán)凱生物科技有限公司   2025年02月11日 14:37  

真菌是一類多樣性豐富的微生物,隨著保存時間的延長和不斷的傳代需要,真菌的毒力、致病性、生長速度等基本特性會發(fā)生改變。為了最大限度保持真菌的活性、形態(tài)學、生理學、遺傳完整性等特性,往往需要幾種培養(yǎng)和保存方法。理想情況下,保存的菌種在長期保存下仍具有活性,但處于靜止狀態(tài),以防突變的積累導致形本學和生化特性的改變。常用的菌種保存方法有持續(xù)傳代,保存于無菌水、土壤或礦物油中,冷凍或真空干燥等。

持續(xù)傳代法是將真菌持續(xù)地在瓊脂上接種生長,是一種短期的保存方法。將培養(yǎng)物存放于4~25℃ 或?qū)⑵淅鋬隹梢栽黾觽鞔拈g隔。將真菌保存于無菌水放置在室溫是一種簡易經(jīng)濟的方法,但真菌細胞的穩(wěn)定性無法得到保障。利用冷凍法,如液氮或低溫(一20℃和-80℃)可以較好地彌補水保存法的不足。國際上的一些真菌研究機構(gòu)推薦使用冷凍法和凍干法進行菌種保存。盡管對活細胞進行凍干可以長期保證細胞的穩(wěn)定性,但整個程序冗長耗時,且需要昂貴的設(shè)備。因此冷凍法的使用最為廣泛,大多數(shù)真菌可使用此法進行保存。

一、水保存法

1)操作步驟
1、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養(yǎng)基,置于25℃培養(yǎng)2周,向培養(yǎng)管內(nèi)加入6~7ml 的無菌蒸餾水。 
2、使用移液器槍頭在斜面上輕輕刮取孢子或菌絲片段,收集上清懸液并轉(zhuǎn)移至無菌的帶螺口瓶內(nèi)。 
3、將瓶蓋旋緊,以防止水分的蒸發(fā),如發(fā)生蒸發(fā)可定期添加無菌蒸餾水,在瓶上做好標記儲存于室溫。 

2)活性檢測:無菌條件下從瓶內(nèi)吸取0.3ml懸液接種至SDA或PDA斜面,于25℃培養(yǎng)3周,定期觀察生長情況3周后如無生長,或重復轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后仍無生長,表明保種物無活性。

二、冷凍保存法

1)操作步驟:
1、將真菌接種在帶螺口蓋的聚丙烯管PDA斜面培養(yǎng)基,置于25℃培養(yǎng)2周。 
2、旋緊瓶蓋,置于冷凍冰箱(-20℃以下) 。

2)活性檢測:從冰箱取出培養(yǎng)管,自冰凍的PDA斜面挖取一小部分菌落接種至另一PDA斜面培養(yǎng)基,于25 ℃培養(yǎng)至少3周。如復蘇生長的菌落特點與保種之前的特性一致,表明保種切實可行;如轉(zhuǎn)種的菌落無生長或菌落的特性與初始特性不一致,按上述方法重復轉(zhuǎn)種。如第二次轉(zhuǎn)種仍無生長表明保種失敗。 
注意:培養(yǎng)管自冰箱取出后應(yīng)盡快操作,避免融化,盡快放回冰箱,否則影響真菌的存活率。 

三、礦物油浸沒法

1)操作步驟:
1、準備高等級的礦物油,121℃高壓15min。 
2、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養(yǎng)基,置于25℃培養(yǎng)2周。
3、向培養(yǎng)管內(nèi)加入礦物油,以礦物油高出斜面1cm為宜,確保培養(yǎng)管的斜面和所有菌落完quan被浸沒。
4、將培養(yǎng)管直立放置于室溫,定期觀察礦物油水平及含量,必要時適量添加。 

2)活性檢測:從保種培養(yǎng)斜面挑取小量菌落接種至適當?shù)呐囵B(yǎng)基(PDA或SDA),取菌時盡量瀝去礦物油。由于菌落黏附礦物油,菌落的生長速度會較慢,可能需要傳代多次。理想的操作方法可以將菌落接種在斜面培養(yǎng)基的中點,可以使多余的礦物油流至管底。 

四、冷凍干燥法

冷凍干燥保存適合產(chǎn)孢的真菌,特別是一些能夠產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子的真菌,保存周期長,可達20~40年。 

1)操作步驟:
1、將真菌接種在帶螺口蓋的玻璃管PDA斜面培養(yǎng)基,置于25℃培養(yǎng)至生長良好。
2、刮取適量真菌與保護劑(如脫脂牛奶)混勻后,加入安瓿瓶中,在一40℃冰箱預冷2h。 
3、置于冷凍干燥機上冷凍干燥8~20h,熔封。 
4、測定真空度,合格后2-8℃保存。

2)活性檢測:配制液體SGA或者MEA培養(yǎng)基,安瓿瓶打開后將粉末倒入以上培養(yǎng)基,適宜條件下生長1~3周, 保存良好的菌落可以恢復生長。 

方法保護劑溫度保存年限特殊設(shè)備優(yōu)點不足
持續(xù)
培養(yǎng)法
4-25℃1~2年不需要簡便耗費人力,
時間有污袋的風險,
穩(wěn)定性低
蒸餾水
保存法
室溫1~10 年不需要簡便需要有經(jīng)驗的人員
礦物油
保存法
室溫1~40年不需要簡便保存期同繼續(xù)生長,
穩(wěn)定性低
液氮
保存法
甘油,
DMSO
-180 一
-130℃
>40年需要長期穩(wěn)定
,省時
需要有經(jīng)驗的人員,
費用昂貴
凍干法甘油,
DMSO,
脫脂牛奶
2-8℃5~40年需要長期穩(wěn)定需要有經(jīng)驗的人員,
耗時,費用昂貴
低溫
冷凍法
營養(yǎng)培養(yǎng)
基甘油
-80 一
-20℃
5~30年需要簡便,
長期穩(wěn)定
需要冷凍冰箱,
不太適合皮膚癬菌


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