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三維多細胞類球體（腫瘤球、微球、類器官）可以幫助我們在臨床前藥物篩選階段更好地預測多種候選藥物的潛在作用。但是，相較于二維單層培養(yǎng)細胞，采用三維培養(yǎng)細胞模型系統(tǒng)進行檢測分析則更具挑戰(zhàn)性。

一起來看看珀金埃爾默是如何分析3D微組織球三維體積與分區(qū)的吧！

3D微組織球的制備和成像過程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制備細胞球

在CellCarrier Spheroid表面極低吸附力96孔微孔板（珀金埃爾默公司，貨號6055330）中接種 HeLa 細胞，細胞濃度分別為1.25E3、2.5E3與5E3。48小時后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™染料對胞核染色。如前文所述，用磷酸化組蛋白H3抗體（西格瑪奧德里奇公司，貨號H9908）和Alexa 546二抗體（美國生命技術公司，貨號A11081）聯(lián)合標記有絲分裂細胞。為達到快速成像的需求，本實驗應用長工作距離物鏡，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。對于高分辨率深度成像試驗，本實驗將細胞球轉入兼容高質量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃爾默公司，貨號6057300），然后利用ScaleA2試劑進行透明化處理。

“預掃描（PreciScan）”功能大大縮短圖像采集時間并減小數(shù)據(jù)量

研究人員利用Harmony軟件的“預掃描（PreciScan）”功能掃描拍攝所有細胞球的圖像。“預掃描（PreciScan）”是一項智能圖像采集功能，它可以智能識別確定各孔內(nèi)目標細胞的x/y坐標位置。通過低倍預掃描、智能聯(lián)機分析和高倍再掃描，生成目標細胞的高分辨率圖像。再掃描可以包含z-stack多層掃描和 / 或時間序列掃描。“預掃描（PreciScan）”功能有效節(jié)省了測量和分析時間并減小了數(shù)據(jù)儲存空間（例如，使用20x物鏡對在384孔微孔板內(nèi)培養(yǎng)的細胞球進行觀察分析時，預掃描可幫助減少25倍的分析時間和數(shù)據(jù)儲存空間；而使用40x物鏡觀察時，可減少100倍的分析時間和數(shù)據(jù)儲存空間），Operetta CLS與Opera Phenix系統(tǒng)都配置有這一功能。

利用水浸物鏡與光透明化技術優(yōu)化成像深度

使用水浸物鏡，大大提高了成像質量，特別是提升了Z軸分辨率。此外，光透明化處理進一步改善了成像深度。光透明化處理不僅提高了樣品內(nèi)指標的均一性，而且減少了光散射和光學像差。在此基礎上，采用長波長染色（如可行）也有利于減少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D樣品上。因此，可顯著提升成像深度和信號檢測效率。

3D微組織球重構與分析

生成三維或 XYZ 軸圖像

生成三維樣品的 XYZ 軸或三維圖像；

在三維空間中變換樣品圖像——旋轉、縮放或平移；

導出視頻——三維重建或涵蓋多層平面視圖的視頻。

定位細胞球與胞核

使用“定位圖像區(qū)域（Find Image Region）”功能定位整個細胞球；

采用局部光強閾值進行 Z 軸光衰減補償；

選用一種“定位胞核（Find Nuclei）”方法——專門用于 3D 圖像胞核分割。

計算細胞球與胞核三維指標

使用“計算形態(tài)特性參數(shù)（Calculate Morphology Properties）”工具分析細胞球和球體內(nèi)單細胞的三維形態(tài)特征。

定位有絲分裂細胞

使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根據(jù)局部光強閾值定位有絲分裂、 pHH3 陽性細胞；

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”功能生成剖視圖，從內(nèi)部（右側）觀察細胞球。

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”工具生成剖視圖

進行細胞分區(qū)，分析有絲分裂細胞分布情況

計算出每個胞核到細胞球邊界的短距離；

使用“選擇區(qū)域”和“選擇細胞群”功能，將胞核分成不同區(qū)域?？呻S意調整區(qū)域寬度；

分析每個區(qū)域有絲分裂細胞數(shù)量和空間分布差異，得到各種不同的分析數(shù)據(jù)（例如，細胞形態(tài)參數(shù)）。

使用“裁剪區(qū)（Clip Box）”工具生成剖視圖

基于Harmony4.8軟件的整體成像細胞球三維分析方法我們可以檢測到細胞球整體的形態(tài)學特征和細胞球同心區(qū)單細胞特性。采用DRAQ5™染料（紅色）和pHH3抗體（橙色）標記細胞球，然后用ScaleA2試劑進行光透明化處理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系統(tǒng)裝配的20x水浸物鏡（數(shù)值孔徑1.0）和間距為1µm的 z-stack模塊（z軸掃描高度：300µm）記錄共聚焦三維圖像。Opera Phenix系統(tǒng)的3D成像質量更佳。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，Operetta CLS系統(tǒng)在被測HeLa細胞球的成像深度和胞核檢測性能方面與之不相上下。此處第4和第5步驟操作僅以Opera Phenix系統(tǒng)成像展示，Operetta CLS系統(tǒng)成像效果與之相當。

參考文獻

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