蛋白A（Protein A）ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

貨號(hào)：HG-PA001

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

BlueKit系列系列蛋白A（Protein A）ELISA檢測(cè)試劑盒是用于定量檢測(cè)生物制品中蛋白A殘留量的專(zhuān)用試劑盒。

本試劑盒采用雙抗夾心法，用捕獲抗體包被96孔酶標(biāo)板，制成固相抗體，隨后加入標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣品，再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)抗體，形成一個(gè)固相抗體-蛋白A-酶標(biāo)抗體的三明治結(jié)合物，反應(yīng)結(jié)束后洗滌，然后加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，底物在HRP的催化下由無(wú)色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)變成最終的黃色。在450nm和630nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值（OD值），其中630nm為校正波長(zhǎng)。OD值與樣品中的蛋白A含量呈正相關(guān)。

檢測(cè)范圍： 5.12 - 500 pg/mL
定  量  限： 5.12 pg/mL
準(zhǔn)  確  度： 80% - 120%

規(guī)格：

96T

應(yīng)用：

適用于生物制品純化工藝過(guò)程的優(yōu)化、中間工藝過(guò)程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測(cè)。

試劑盒組成：

備 注:所有組分存儲(chǔ)溫度均為 2~8℃，有效期12個(gè)月。

需自行準(zhǔn)備的材料

◆酶標(biāo)儀

◆去離子水

◆微孔板恒溫振蕩器

◆全新濾紙

◆微量移液器及吸頭

◆渦旋振蕩器

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.1x樣品稀釋液配制: 取樣品稀釋液（20×）加去離子水稀釋20倍備用，如：取樣品稀釋液（20×）10mL加去離子水190mL混勻。

2.1x 洗液配制：取洗液（20×）加去離子水稀釋20倍備用，如：取洗液（20×）10mL 加去離子水190mL混勻。
（注意：樣品稀釋液（20×）、洗液（20×）中如果有結(jié)晶形成，應(yīng)置于室溫或37℃水浴輕輕搖晃，待結(jié)晶完-全溶解后再進(jìn)行稀釋?zhuān)?/span>

3.顯色液配制：將顯色液A、顯色液B等體積混合，混勻后避光放置。（注：不能放置太久，一般使用前的10min配制。如混合后顯色液已經(jīng)變藍(lán)，請(qǐng)勿使用）。
4.標(biāo)準(zhǔn)品的制備（注：每次實(shí)驗(yàn)需使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液）
試劑盒中放置不同類(lèi)型的Protein A標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)根據(jù)所使用的Protein A親和樹(shù)脂類(lèi)型選擇對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若無(wú)法獲得對(duì)應(yīng)的Protein A配基，對(duì)于重組型樹(shù)脂，可使用本試劑盒中的重組Protein A（楚天微球）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)于耐堿型樹(shù)脂，可使用本試劑盒中適用于MabSelect SuRe配基的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
稀釋過(guò)程：用樣品稀釋液（1×）將標(biāo)準(zhǔn)品（50ng/mL）稀釋至500pg/mL，然后系列倍比（稀釋倍數(shù)：2.5 倍）稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)品，如下圖。

5. 待測(cè)樣品稀釋?zhuān)簩悠坊謴?fù)至室溫，混勻；使用樣品稀釋液（1×）將樣品進(jìn)行稀釋。針對(duì)不同樣品，需要進(jìn)行樣品濃度稀釋倍數(shù)的驗(yàn)證。推薦樣品稀釋濃度范圍為0.01-1mg/mL。
6. 加標(biāo)樣品制備：選擇合適濃度的待測(cè)樣品，分為體積相同的3-4份，在其中2-3份樣品中加入不同濃度相同體積的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品，制備待回收分析樣品。待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品加入體積小于等于總體積的10%，制成2-3 個(gè)不同濃度的待回收分析樣品，計(jì)算加入的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。

操作步驟

所有操作在室溫（18-25℃）下進(jìn)行，建議所有加樣孔進(jìn)行復(fù)孔測(cè)定。
1.將試劑盒各組分恢復(fù)室溫30min，從已平衡至室溫的鋁箔袋中取出試驗(yàn)所需板條，用記號(hào)筆標(biāo)記板條順序，剩余板條用封板膜封板后重新放回鋁箔袋中，封好，置于2-8℃保存。（注：在洗板過(guò)程中板條容易脫落，注意做好標(biāo)記。）
2.樣品溫育：將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中（加入順序建議：標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣品孔、加標(biāo)樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度加入），100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振蕩溫育1h。（注：加樣時(shí)間控制在 10min 以?xún)?nèi)，避免隨時(shí)間出現(xiàn)的漂移。溫育過(guò)程中如果不封板或者封板不完-全，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液蒸發(fā)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。）
3.洗板：溫育完成后，小心揭去封板膜，棄去孔中液體，用樣品稀釋液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的殘留液體。（如果洗板方式為手洗，加樣品稀釋液（1×）后可靜置1min；如果采用洗板機(jī)洗板，加樣品稀釋液（1×）后可輕微震蕩5s）
4.酶標(biāo)抗體溫育：加入酶標(biāo)抗體，100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振蕩溫育1h。
5.洗板：溫育完成后，小心揭去封板膜，棄去孔中液體，用洗液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的殘留液體。
6.顯色：將預(yù)先配置好的顯色液加入酶標(biāo)板中，100µL/孔，用封板膜封板，37℃避光靜置溫育15min。
7.終止：加入終止液，100µL/孔，顯色均勻后即可讀數(shù)。（注：一般加入終止液后10min內(nèi)完成）
8.讀數(shù)：將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置波長(zhǎng)為雙波長(zhǎng)450/630nm，讀取吸光度值。（注：建議在酶標(biāo)儀讀數(shù)程序中設(shè)置5-10s的震蕩）。

結(jié)果處理

以下標(biāo)準(zhǔn)曲線圖僅供參考，應(yīng)以同次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)。
1.適用于MabSelect SuRe配基標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2. 適用于MabSelect PrismA配基標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.重組Protein A（楚天微球）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.MaXtar^® ARPA ligand Protein A（百林科 Bio-Link）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注意事項(xiàng)

1.樣品首i次檢測(cè)，建議進(jìn)行至少3個(gè)連續(xù)倍數(shù)的稀釋?zhuān)栽跇?biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)產(chǎn)生至少一個(gè)稀釋后樣品。

2.試劑按標(biāo)簽說(shuō)明儲(chǔ)存，使用前室溫(18~25℃℃)平衡。3.包被酶標(biāo)板使用前，請(qǐng)平衡至室溫(18~25°C)再打開(kāi)外包裝袋，實(shí)驗(yàn)中不用的板條立即放回包裝中密封，4℃可保存一個(gè)月。其余不用試劑應(yīng)包裝好或蓋好。

4.實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

5.使用前檢查試劑盒內(nèi)各種試劑。試劑稀釋、加樣和終止反應(yīng)應(yīng)充分混勻或搖勻?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果尤為重要。

6.洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在潔凈的紙中上充分拍干，直至看不到水印。勿將紙巾直接放入反應(yīng)孔中吸水。

7.底物顯色液對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下，避免與金屬接觸影響結(jié)果。

8.本產(chǎn)品為一次性使用的試劑盒，請(qǐng)?jiān)谛趦?nèi)使用。

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