三種模式應(yīng)用于聚合物分離
通常來講，對(duì)于聚合物的分離，主要方法為體積排阻色譜（SEC）和液體吸附色譜（LAC），然而在這兩個(gè)模式之間，存在著所謂的臨界條件下液相吸附色譜法(LACCC)。原理上，對(duì)于所有的模式都是根據(jù)分子的特性來對(duì)聚合物進(jìn)行分離。
其實(shí)，在這三種模式中使用超臨界 CO2 只是停留在早期的研究中，但是隨著 SFC 領(lǐng)域的快速發(fā)展，又燃起了我們對(duì)于這些模式研究的希望！本篇文章，我們將會(huì)以聚乙二醇（PEG）為模型展示這三種模式下的分離狀態(tài)。為了確定臨界條件下的色譜參數(shù)，采用了質(zhì)量設(shè)計(jì)（QbD）的方法來減少所需的實(shí)驗(yàn)。
聚合物分離的色譜原理
超臨界條件下 體積排阻色譜 scSEC | 臨界條件下 超臨界流體吸附色譜 SFACCC | 超臨界流體 吸附色譜 SFAC |
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表1. 超臨界流體色譜法對(duì)聚合物不同分離方式的比較。哪種模式占主導(dǎo)地位取決于色譜條件，主要是溶劑強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
實(shí)驗(yàn)條件 | ||
色譜柱 | 250 mm x 20 mm, 5μm (制備柱) Reprosil SEC 200? (Dr. Maisch, Germany) 150 mm x 2.1 mm, 1.9μm (分析柱) | |
儀器 | 分析型：Waters UPC2 with Acquity ELSD（Waters） 制備型：Sepiatec SFC-250 with ELSD（Sepiatec） | |
軟件 | Fusion QbD software (S-Matrix Corp.) | |
SFACCC 中使用 QbD 對(duì)聚合物進(jìn)行條件篩選與分離
QbD 法確定關(guān)鍵色譜條件：
在第一次篩選后，使用 QbD 方法以最少的實(shí)驗(yàn)確定關(guān)鍵色譜條件
在較小的條件區(qū)域內(nèi)，所有共洗脫的聚乙二醇都可以得到，圖中用白色背景表示
這一點(diǎn)通過實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證
PEG-400 與聚多卡醇(端基為 C12-烷基的 PEG-400)在如下條件分離：
名稱 | 目標(biāo) | 下界 | 上界 | 顏色 |
所有PEGs最大保留時(shí)間差 | 最小 | 0.030 | —— | 紅色 |
聚多卡醇/PEG400保留時(shí)間差 | 最大 | —— | 0.100 | 綠色 |
▲圖1.由 Fusion QbD 軟件生成的方法設(shè)計(jì)；
在臨界色譜條件 T 中進(jìn)行
▲圖2.在臨界色譜條件：36% 甲醇和 56℃ 下，不同 PEG 的共洗脫(上圖)和 PEG-400 與聚多卡醇的分離(下圖)
在相同系統(tǒng)下采用 SEC 與吸附色譜對(duì)聚乙二醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)條件 | ||
色譜柱 | 200 ?; 1.9μm | |
背壓調(diào)節(jié)閥 | 1800psi（124bar） | |
洗脫液 | CO2（A）/甲醇（B） | |
流速 | 1 mL/min | |
溫度 | 40℃ | |
檢測(cè)器 | ELSD | |
▲圖3.scSEC：等度模式；10/90（CO2/甲醇）
▲圖4.SFAC：梯度模式；
十分鐘之內(nèi) 90/10 – 50/50（CO2/甲醇）
▲5.SFAC：等度模式；90/10（CO2/甲醇）
scSEC色譜法在亞臨界條件下通過高比例的強(qiáng)溶劑進(jìn)行等度洗脫，高分子量的 PEG 更早的洗脫出來。
SFAC色譜法通過梯度洗脫模式對(duì) 20kDa – 200Da 分子量范圍內(nèi)的 PEG 進(jìn)行洗脫。后續(xù)采用低比例改性劑的等度模式對(duì)可將 PEG-200 和 PEG-400 分散劑分解為其單分散組分。分子量的確認(rèn)通過 SFC-MS 聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。
SEC校準(zhǔn)：將衍生化均勻聚合物與常規(guī) PEGs 分散劑進(jìn)行校準(zhǔn)比較，以此來證明均勻聚合物的可用性。
制備分離 PEG-400 里均勻聚合物
實(shí)驗(yàn)條件 | ||
儀器 | Sepiatec SFC-250 | |
色譜柱 | 200 ?; 5μm | |
洗脫液 | CO2（A）/甲醇（B）= 93/7 | |
流速 | 60 mL/min | |
溫度 | 40℃ | |
檢測(cè)器 | ELSD | |
▲圖6.通過 SFAC 色譜模式對(duì) PEG-400 均勻聚合物進(jìn)行分離效果圖譜
聚合物純度驗(yàn)證：在分析層面上使用開發(fā)的 SFAC 色譜法對(duì)均勻聚合物的純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明即使在不優(yōu)化分離條件的情況下，所有聚合物的純度都＞99%。
結(jié)論
通過改變 CO2 和甲醇的比例，三種模式均可在相同的系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。除此之外，在實(shí)際應(yīng)用中，通過將開發(fā)的分析方法順利轉(zhuǎn)移到制備規(guī)模中，對(duì)不同分子量的聚乙二醇進(jìn)行分離純化且得到了均勻的聚合物。
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