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畢赤酵母表達(dá)體系純化人胰島新生相關(guān)蛋白

閱讀:149      發(fā)布時(shí)間:2025-2-7
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摘要

本研究旨在利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化人胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP),以探索其在胰島再生和糖尿病治療中的潛在應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系,優(yōu)化表達(dá)條件,并采用親和層析等方法純化目標(biāo)蛋白。結(jié)果顯示,畢赤酵母體系能高效表達(dá)并純化INGAP,為糖尿病治療提供新思路。

引言

胰島新生相關(guān)蛋白(Islet Neogenesis Associated Protein,INGAP)是一種具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰島分化和再生的蛋白質(zhì),其在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。INGAP的發(fā)現(xiàn)和研究為糖尿病的治療提供了新的方向,尤其是在胰島移植和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而,INGAP的獲取和純化一直是制約其研究和應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的INGAP獲取方法主要依賴于從天然組織中提取,這種方法不僅效率低下,而且難以獲得高純度的INGAP。因此,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建INGAP的高效表達(dá)體系,并實(shí)現(xiàn)其純化,對(duì)于推動(dòng)INGAP的研究和應(yīng)用具有重要意義。

畢赤酵母(Pichia pastoris)作為一種常用的真核表達(dá)系統(tǒng),具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)和純化。畢赤酵母表達(dá)體系能夠完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過(guò)程,如糖基化、剪切和磷酸化等,從而確保目標(biāo)蛋白的生物活性和功能。

本研究旨在利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化INGAP,通過(guò)構(gòu)建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系,優(yōu)化表達(dá)條件,并采用親和層析等方法純化目標(biāo)蛋白。期望通過(guò)本研究,為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持,為糖尿病治療提供新的思路和方法。

一、材料與方法

1. 材料

  • 菌株與載體:畢赤酵母GS115菌株,INGAP基因表達(dá)載體pPIC9K(含AOX1啟動(dòng)子和α-factor信號(hào)肽序列)。

  • 試劑:某試劑公司的YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、甲醇、SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、G25凝膠過(guò)濾柱等。

  • 儀器設(shè)備:某品牌電泳儀、某品牌離心機(jī)、某品牌振蕩培養(yǎng)箱、某品牌分光光度計(jì)、威尼德電穿孔儀等。

2. 方法

2.1 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

  • 將INGAP基因插入到表達(dá)載體pPIC9K中,構(gòu)建INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒。

  • 采用電穿孔法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株中,篩選高拷貝陽(yáng)性克隆。

2.2 表達(dá)條件的優(yōu)化

  • 將陽(yáng)性克隆接種于YPD培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

  • 轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達(dá)到3-6。

  • 離心收集菌體,用無(wú)菌水洗滌后,重懸于BMMY培養(yǎng)基中,加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

  • 每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇,持續(xù)誘導(dǎo)4天。

2.3 蛋白質(zhì)的純化

  • 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液上清。

  • 采用SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行初步純化。

  • 收集目的峰后,用G25凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。

  • 將純化后的INGAP進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

成功構(gòu)建了INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒,并通過(guò)電穿孔法將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株中。經(jīng)過(guò)篩選,獲得了高拷貝陽(yáng)性克隆。

2. 表達(dá)條件的優(yōu)化

在優(yōu)化的表達(dá)條件下,畢赤酵母能夠高效表達(dá)INGAP。通過(guò)甲醇誘導(dǎo)4天后,發(fā)酵液上清中的INGAP濃度達(dá)到較高水平。

3. 蛋白質(zhì)的純化

經(jīng)過(guò)SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和G25凝膠過(guò)濾柱的純化,獲得了高純度的INGAP。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,純化后的INGAP分子量與預(yù)期相符,且純度較高。Western Blot鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了純化產(chǎn)物的特異性。

三、討論

1. 畢赤酵母表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)

畢赤酵母表達(dá)體系具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點(diǎn),能夠完成復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過(guò)程,從而確保目標(biāo)蛋白的生物活性和功能。在本研究中,畢赤酵母成功表達(dá)了INGAP,并實(shí)現(xiàn)了其高效純化,為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。

2. 純化方法的優(yōu)化

在純化過(guò)程中,采用了SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和G25凝膠過(guò)濾柱的組合純化方法。這種方法不僅能夠有效去除雜質(zhì),提高INGAP的純度,還能夠保持INGAP的生物活性。通過(guò)優(yōu)化純化條件,獲得了高純度的INGAP,為后續(xù)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

3. INGAP的應(yīng)用前景

INGAP作為一種具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰島分化和再生能力的蛋白質(zhì),在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。通過(guò)畢赤酵母表達(dá)體系純化INGAP,為糖尿病治療提供了新的思路和方法。未來(lái),可以進(jìn)一步探索INGAP在胰島移植、胰島再生以及糖尿病治療中的應(yīng)用,為糖尿病患者帶來(lái)更好的治療效果和生活質(zhì)量。

4. 研究的創(chuàng)新點(diǎn)

本研究利用畢赤酵母表達(dá)體系高效純化了INGAP,并優(yōu)化了表達(dá)條件和純化方法。通過(guò)這種方法,可以獲得高純度、活性穩(wěn)定的INGAP,為INGAP的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。此外,本研究還探索了INGAP在糖尿病治療中的潛在應(yīng)用,為糖尿病治療提供了新的思路和方法。


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