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漢灘病毒受體TNFRⅠ載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染建系

閱讀:153      發(fā)布時(shí)間:2025-2-6
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引言


漢灘病毒(Hantavirus)是一種由嚙齒類動(dòng)物傳播的病原體,可引起嚴(yán)重的出血熱和腎綜合征。其感染機(jī)制與宿主細(xì)胞表面的特定受體密切相關(guān),其中腫瘤壞死因子受體Ⅰ(TNFRⅠ)被認(rèn)為是漢灘病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體之一。TNFRⅠ不僅參與病毒的感染過程,還在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。因此,構(gòu)建TNFRⅠ的表達(dá)載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,對于深入研究漢灘病毒的感染機(jī)制、開發(fā)抗病X藥物以及探索宿主免疫應(yīng)答具有重要意義。


本研究通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建TNFRⅠ的表達(dá)載體,并利用威尼德電穿孔儀將載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中,成功建立了穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的細(xì)胞系。通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),證實(shí)了該細(xì)胞系在漢灘病毒感染研究中的應(yīng)用價(jià)值。本文詳細(xì)闡述了實(shí)驗(yàn)材料與方法、結(jié)果分析與討論,并展望了該研究的創(chuàng)新點(diǎn)與應(yīng)用前景。


材料與方法


1. 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞系為HEK293T細(xì)胞,該細(xì)胞系因其高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定的生長特性而被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究。TNFRⅠ基因序列通過某試劑盒從人源cDNA文庫中擴(kuò)增獲得。載體構(gòu)建所使用的質(zhì)粒為某品牌的高效表達(dá)載體pCDNA3.1。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需的威尼德電穿孔儀及配套試劑均來自某品牌。


2. 載體構(gòu)建

首先,通過PCR擴(kuò)增TNFRⅠ基因的全長序列,并在其兩端引入特定的酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pCDNA3.1載體進(jìn)行雙酶切處理,隨后通過T4 DNA連接酶將TNFRⅠ基因插入載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至某品牌的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒后,通過測序驗(yàn)證插入序列的正確性。


3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建成功的TNFRⅠ表達(dá)載體通過威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染條件為:電壓200 V,脈沖時(shí)間10 ms,電穿孔后立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,通過某試劑盒提取細(xì)胞總RNA,利用RT-PCR檢測TNFRⅠ的表達(dá)水平。


4. 穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選

為獲得穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。篩選濃度為500 μg/mL,持續(xù)培養(yǎng)2周。通過有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞,并通過Western blot檢測TNFRⅠ蛋白的表達(dá)水平。


5. 功能驗(yàn)證

為驗(yàn)證TNFRⅠ細(xì)胞系的功能活性,將漢灘病毒接種至穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的HEK293T細(xì)胞中,通過免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒的感染效率。同時(shí),利用某試劑盒檢測細(xì)胞上清中炎癥因子的釋放水平,評估TNFRⅠ在病毒感染過程中的免疫調(diào)節(jié)作用。


結(jié)果


1. 載體構(gòu)建與驗(yàn)證

通過PCR擴(kuò)增獲得了TNFRⅠ基因的全長序列,測序結(jié)果顯示其與參考序列完整一致。將TNFRⅠ基因成功插入pCDNA3.1載體中,并通過酶切和測序驗(yàn)證了載體的正確性。


2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)檢測

威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染后,RT-PCR結(jié)果顯示TNFRⅠ在HEK293T細(xì)胞中高效表達(dá)。Western blot進(jìn)一步證實(shí)了TNFRⅠ蛋白的成功表達(dá),其分子量約為55 kDa,與預(yù)期一致。


3. 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立

通過G418篩選和單克隆分離,成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的HEK293T細(xì)胞系。Western blot結(jié)果顯示,該細(xì)胞系中TNFRⅠ蛋白的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。


4. 功能驗(yàn)證

漢灘病毒感染實(shí)驗(yàn)表明,穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的HEK293T細(xì)胞對病毒的感染效率顯著提高。免疫熒光染色顯示,病毒感染后細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原明顯增多。此外,細(xì)胞上清中炎癥因子(如TNF-α和IL-6)的釋放水平顯著升高,表明TNFRⅠ在病毒感染過程中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。


討論


本研究成功構(gòu)建了TNFRⅠ的表達(dá)載體,并通過威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,建立了穩(wěn)定表達(dá)TNFRⅠ的細(xì)胞系。該細(xì)胞系為漢灘病毒的感染機(jī)制研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),證實(shí)了TNFRⅠ在漢灘病毒感染過程中的關(guān)鍵作用,為抗病X藥物的篩選和宿主免疫應(yīng)答的研究奠定了基礎(chǔ)。


本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將TNFRⅠ與漢灘病毒感染機(jī)制相結(jié)合,并通過穩(wěn)定細(xì)胞系的建立為后續(xù)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。此外,威尼德電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染技術(shù)為基因功能研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。


結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了TNFRⅠ的表達(dá)載體,并通過轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了穩(wěn)定表達(dá)該受體的HEK293T細(xì)胞系。功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該細(xì)胞系在漢灘病毒感染研究中的應(yīng)用價(jià)值。該研究為漢灘病毒的感染機(jī)制研究、抗病X藥物篩選及宿主免疫應(yīng)答的探索提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具和理論基礎(chǔ),具有廣闊的應(yīng)用前景。


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