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威尼德生物科技(北京)有...

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攻克前白蛋白 cDNA 克隆與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株

閱讀:218      發(fā)布時間:2025-2-5
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引言

前白蛋白(PA),又稱前清蛋白,是一種由肝臟細胞合成的糖蛋白,分子量約為55kD,血漿半衰期為1.9天。因其電泳遷移速度在白蛋白之前而得名。PA在肝功能評價、肝病診斷及預(yù)后判斷中具有重要價值。各種類型肝病的PA水平均低于正常水平,且肝病越嚴重,血清PA水平越低。此外,PA還作為一種急性時相反應(yīng)蛋白,可用于炎癥反應(yīng)的監(jiān)測,以及營養(yǎng)不良、消耗性疾病、腎病和妊娠等疾病的診療。

然而,天然PA的來源有限,且提取過程復(fù)雜,難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的需求。因此,通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)PA成為研究熱點。本研究旨在克隆前白蛋白cDNA,并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,為實現(xiàn)PA的規(guī)?;a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建前白蛋白cDNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株具有多方面的重要意義。首先,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株能夠在較長時間內(nèi)維持基因表達的一致性,這對于生產(chǎn)生物制品的批間差異控制至關(guān)重要。其次,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建有助于深入研究PA的功能和調(diào)控機制,為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的思路和方法。最后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立也是實現(xiàn)PA基因工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的重要步驟。

材料與方法

  1. 實驗材料

    • 人胚肝組織總RNA:作為模板用于RT-PCR擴增前白蛋白cDNA。

    • pGEM-T Easy載體:用于前白蛋白cDNA的初步克隆。

    • pCDNA3.1(+)載體:用于構(gòu)建真核表達重組體。

    • Hela細胞:作為宿主細胞用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

    • 某試劑:用于RT-PCR、DNA克隆、質(zhì)粒提取、細胞培養(yǎng)等實驗。

    • 威尼德電穿孔儀:用于細胞轉(zhuǎn)染過程中的電穿孔操作(本研究未采用電穿孔法,但提及以展示完整儀器信息)。

    • G418抗生素:用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

  2. 實驗方法

    • 前白蛋白cDNA的克隆:以人胚肝組織總RNA為模板,通過RT-PCR擴增全長前白蛋白cDNA。將擴增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體中,進行測序驗證。

    • 真核表達重組體的構(gòu)建:將測序正確的前白蛋白cDNA亞克隆到pCDNA3.1(+)載體中,構(gòu)建真核表達重組體pCDNA3.1(+)-PA。通過限制性內(nèi)切酶消化和DNA序列分析鑒定重組體的正確性。

    • 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達重組體pCDNA3.1(+)-PA導(dǎo)入Hela細胞。通過G418抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

    • 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的鑒定:通過RT-PCR和Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中前白蛋白基因和蛋白的表達情況。

實驗結(jié)果

  1. 前白蛋白cDNA的克隆與測序

    通過RT-PCR成功擴增了全長前白蛋白cDNA,并將其克隆到pGEM-T Easy載體中。測序結(jié)果顯示,克隆的前白蛋白cDNA序列與預(yù)期序列一致,無突變或缺失。

  2. 真核表達重組體的構(gòu)建與鑒定

    將測序正確的前白蛋白cDNA亞克隆到pCDNA3.1(+)載體中,構(gòu)建了真核表達重組體pCDNA3.1(+)-PA。通過限制性內(nèi)切酶消化和DNA序列分析,確認重組體構(gòu)建正確。

  3. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建與篩選

    利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達重組體pCDNA3.1(+)-PA導(dǎo)入Hela細胞。通過G418抗生素篩選,成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。篩選過程中,觀察到細胞形態(tài)良好,生長速度正常。

  4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的鑒定

    通過RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中前白蛋白基因的表達情況。結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中前白蛋白基因表達水平顯著高于未轉(zhuǎn)染細胞。同時,通過Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中前白蛋白蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株能夠高效表達前白蛋白蛋白。

討論

  1. 前白蛋白cDNA克隆與測序的準確性

    本研究以人胚肝組織總RNA為模板,通過RT-PCR成功擴增了全長前白蛋白cDNA。測序結(jié)果顯示,克隆的前白蛋白cDNA序列與預(yù)期序列一致,無突變或缺失。這保證了后續(xù)實驗的穩(wěn)定性和可靠性。

  2. 真核表達重組體構(gòu)建的策略

    本研究選擇了pCDNA3.1(+)載體作為真核表達載體。該載體具有高效的啟動子和增強子元件,能夠驅(qū)動外源基因在真核細胞中的高效表達。同時,該載體還具有方便的克隆位點和篩選標記,便于后續(xù)的實驗操作。

  3. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建的方法與優(yōu)化

    本研究采用了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達重組體導(dǎo)入Hela細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點。在篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的過程中,通過優(yōu)化G418抗生素的濃度和篩選時間,成功獲得了生長良好、表達穩(wěn)定的細胞株。

  4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

    本研究的創(chuàng)新之處在于成功構(gòu)建了前白蛋白cDNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,為實現(xiàn)前白蛋白的規(guī)?;a(chǎn)提供了堅實基礎(chǔ)。該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株具有生長速度快、表達水平高、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點,可廣泛應(yīng)用于前白蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)、功能研究和疾病診斷等領(lǐng)域。此外,該研究成果還可為其他基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)提供借鑒和參考。

    在應(yīng)用前景方面,前白蛋白作為一種重要的生物標志物和藥物靶點,在肝病診斷、炎癥反應(yīng)監(jiān)測以及營養(yǎng)不良、消耗性疾病等疾病的診療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株實現(xiàn)前白蛋白的規(guī)?;a(chǎn),有望降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率,滿足臨床和科研需求。

結(jié)論

本研究成功克隆了前白蛋白cDNA,并構(gòu)建了真核表達重組體pCDNA3.1(+)-PA。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功將其導(dǎo)入Hela細胞,建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株能夠高效表達前白蛋白蛋白,為前白蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了堅實基礎(chǔ)。本研究成果不僅具有理論意義,還具有重要的應(yīng)用價值,有望為前白蛋白的相關(guān)研究和應(yīng)用開辟新的道路。


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