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摘要：

本文研究了通過電穿孔法使用線性多核苷酸增強真核細胞轉染的效率和效果。實驗采用威尼德電穿孔儀，利用優(yōu)化后的電穿孔參數，成功在人類造血細胞，特別是樹突細胞（DC）中實現高效基因遞送。該方法優(yōu)于傳統(tǒng)脂質體轉染和質粒cDNA電穿孔，為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供了有力工具。

引言：

基因遞送是基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療中的關鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)方法如脂質體轉染和質粒cDNA電穿孔雖已廣泛應用，但存在轉染效率低、細胞毒性大等問題。線性多核苷酸作為基因遞送的載體，具有穩(wěn)定性高、易于合成和修飾等優(yōu)點。然而，如何高效地將線性多核苷酸遞送到真核細胞中，仍是當前研究的熱點和難點。

電穿孔法作為一種物理轉染方法，通過施加短暫的高壓電脈沖，在細胞膜上形成瞬時微孔，使帶電荷的分子如DNA、RNA等能夠進入細胞內。與其他轉染方法相比，電穿孔法具有操作簡便、適用范圍廣、轉染效率高等優(yōu)點。本研究旨在通過優(yōu)化電穿孔參數，使用線性多核苷酸作為載體，增強真核細胞的轉染效率和效果，為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供新的策略和方法。

材料與方法：

1. 實驗材料：

• 細胞：人類外周血單核細胞（PBMC）、單核細胞衍生的樹突細胞（Mo-DC）。

• 線性多核苷酸：增強型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA。

• 試劑：某試劑IMDM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、Optimix培養(yǎng)基、電穿孔緩沖液、成熟刺激劑（IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等）。

• 儀器：威尼德電穿孔儀、流式細胞儀（FACS）。

2. 實驗方法：

• 細胞培養(yǎng)與分化：從新鮮血液中分離PBMC，用IMDM培養(yǎng)基洗滌后，用電穿孔洗滌緩沖液洗滌，并以一定密度重新懸浮在Opti-MEM或Optimix培養(yǎng)基中。對于Mo-DC的分化，將PBMC在補充了GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-7天。

• 電穿孔轉染：在電穿孔前，將EGFP mRNA添加到細胞中，混合均勻后，將細胞懸浮液轉移到威尼德電穿孔儀的樣品池中。設置合適的電穿孔參數（如電壓、脈沖時間、電容等），觸發(fā)電穿孔。

• 細胞成熟與檢測：對于Mo-DC，在電穿孔后，通過添加成熟刺激劑誘導其成熟。在轉染后不同時間點，使用流式細胞儀檢測EGFP的表達水平和細胞存活率。

實驗結果：

1. 轉染效率：

   實驗結果表明，通過優(yōu)化電穿孔參數，本研究成功在人類造血細胞，特別是Mo-DC中實現了高效基因遞送。在不成熟的Mo-DC中，使用400V的電壓和500μs的脈沖時間，轉染效率可達4%以上。進一步提高電壓至600V，轉染效率有所增強，但細胞存活率略有下降。

2. 細胞存活率：

   電穿孔后，細胞存活率受到一定影響。然而，通過優(yōu)化電穿孔參數和細胞培養(yǎng)條件，本研究成功地將細胞死亡率控制在較低水平。在電穿孔后96小時，即使使用600V的電壓，死亡細胞數量也僅為大約16%。

3. 基因表達與細胞成熟：

   在轉染后不同時間點，通過流式細胞儀檢測EGFP的表達水平。結果表明，EGFP在Mo-DC中成功表達，且表達水平隨時間逐漸增加。同時，通過添加成熟刺激劑，成功誘導了Mo-DC的成熟。成熟后的Mo-DC具有更強的轉基因表達能力和更低的細胞死亡率。

4. 冷凍保存與復蘇：

   實驗還探索了轉染后的Mo-DC的冷凍保存與復蘇效果。結果表明，在電穿孔后18小時冷凍的不成熟的Mo-DC在解凍后能夠很好地存活并表達EGFP。然而，在解凍后24小時，與在電穿孔后已培養(yǎng)了48小時的未冷凍對照相比，冷凍培養(yǎng)物具有高水平的細胞死亡率。相比之下，成熟的Mo-DC比冷凍的不成熟Mo-DC更好地從解凍過程中存活下來。

討論：

1. 電穿孔參數優(yōu)化：

   電穿孔參數是影響轉染效率和細胞存活率的關鍵因素。本研究通過優(yōu)化電壓、脈沖時間、電容等參數，成功在人類造血細胞中實現了高效基因遞送。結果表明，適當的電壓和脈沖時間可以顯著提高轉染效率，但過高的電壓會導致細胞死亡率增加。因此，在實際應用中需要根據細胞類型和實驗需求選擇合適的電穿孔參數。

2. 細胞類型與分化狀態(tài)：

   不同細胞類型和分化狀態(tài)對電穿孔轉染的效率和效果具有顯著影響。本研究發(fā)現，在人類造血細胞中，Mo-DC具有較高的轉染效率和較低的細胞死亡率。此外，不成熟的Mo-DC在轉染后更容易誘導成熟，而成熟的Mo-DC則具有更強的轉基因表達能力和更低的細胞死亡率。這些結果為后續(xù)研究和應用提供了重要參考。

3. 基因治療與免疫治療：

   本研究為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供了新的策略和方法。通過電穿孔法將線性多核苷酸遞送到真核細胞中，可以實現高效基因表達和功能調控。這對于治療遺傳性疾病、感染性疾病和癌癥等具有重要意義。同時，該方法還可以用于制備基于DC的腫瘤疫苗和免疫治療試劑，為癌癥治療提供新的途徑和手段。

4. 創(chuàng)新與應用前景：

   本研究在電穿孔轉染技術方面取得了重要創(chuàng)新。通過優(yōu)化電穿孔參數和使用線性多核苷酸作為載體，成功實現了高效基因遞送和細胞功能調控。該技術具有操作簡便、適用范圍廣、轉染效率高等優(yōu)點，在基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療等領域具有廣闊的應用前景。