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基于定向改造的釀酒酵母丙酮酸積累探究

閱讀:197      發(fā)布時(shí)間:2025-1-18
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摘要

本文研究了基于定向改造的釀酒酵母丙酮酸積累,通過基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化,顯著提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%,為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略。

引言

丙酮酸是生物細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑(EMP)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,不僅在生物能量代謝中具有重要作用,而且是多種有用物質(zhì)的前體,廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)藥、農(nóng)用化學(xué)品及生物制藥等領(lǐng)域。目前,丙酮酸的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵,其中光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)是常用的生產(chǎn)菌株。然而,光滑球擬酵母是一種條件致病菌,存在潛在的安全威脅。相比之下,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種的安全菌,在食品工業(yè)和酒精生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用,因此更適合作為丙酮酸的生產(chǎn)菌株。

釀酒酵母中的丙酮酸主要通過糖酵解途徑生成,并隨后進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑被轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳。為了提高釀酒酵母中丙酮酸的積累量,需要阻斷乙醇生成途徑,使代謝流更多地流向丙酮酸。丙酮酸脫羧酶(PDC)是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的關(guān)鍵酶,通過敲除PDC基因,可以阻斷乙醇生成途徑,從而提高丙酮酸的積累量。

本研究旨在通過定向改造釀酒酵母,敲除PDC基因,并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,提高丙酮酸的積累量。這不僅有助于解決光滑球擬酵母的安全性問題,還能為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的策略。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料
  • 菌株:釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2

  • 試劑:某試劑G418、某試劑醋酸鋰、某試劑PCR試劑、某試劑Southern blot試劑、某試劑葡萄糖、某試劑蛋白胨、某試劑酵母粉、某試劑KH2PO4、某試劑MgSO4·7H2O、某試劑醋酸鈉、某試劑玉米漿

  • 儀器:威尼德電穿孔轉(zhuǎn)化儀、某品牌PCR儀、某品牌凝膠成像系統(tǒng)、某品牌搖床、某品牌發(fā)酵罐

2. 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 基因敲除
  1. pdcl基因敲除:設(shè)計(jì)pdcl基因的敲除片段(P1K),通過電穿孔轉(zhuǎn)化法將敲除片段轉(zhuǎn)化到釀酒酵母S. cerevisiae Y2中,在含G418抗性的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。通過PCR和Southern blot驗(yàn)證得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiae Y2-1。

  2. pdc5基因敲除:設(shè)計(jì)pdc5基因的敲除片段(P5H),通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將敲除片段轉(zhuǎn)化到S. cerevisiae Y2-1中,在YNBG平板上篩選轉(zhuǎn)化子。通過PCR和Southern blot驗(yàn)證得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
  1. 種子培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,醋酸鈉2g/L,玉米漿0.5%,pH 5.6。

  2. 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,醋酸鈉2.5g/L,玉米漿1%,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,金屬離子母液5mL,pH 5.6。

  3. 發(fā)酵條件:種齡26h,接種量12%,裝液量70mL/250mL三角瓶。

2.3 丙酮酸測定

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中丙酮酸的濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 基因敲除結(jié)果

通過PCR和Southern blot驗(yàn)證,成功得到了pdcl基因敲除菌株S. cerevisiae Y2-1和pdcl、pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的發(fā)酵條件下,S. cerevisiae Y2-15的丙酮酸積累量顯著提高。與優(yōu)化前相比,丙酮酸的積累量從9.25g/L提高到24.85g/L,提高了168%。

討論

1. 基因敲除對丙酮酸積累的影響

PDC基因是釀酒酵母中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的關(guān)鍵酶基因。通過敲除PDC基因,阻斷了乙醇生成途徑,使代謝流更多地流向丙酮酸。本研究中,首先敲除了pdcl基因,得到S. cerevisiae Y2-1菌株,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除了pdc5基因,得到S. cerevisiae Y2-15菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除兩個(gè)PDC基因后,丙酮酸的積累量顯著提高,說明基因敲除策略是有效的。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化對丙酮酸積累的影響

發(fā)酵條件對微生物代謝產(chǎn)物的積累具有重要影響。本研究通過優(yōu)化種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,顯著提高了S. cerevisiae Y2-15菌株的丙酮酸積累量。優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基提供了適宜的營養(yǎng)物質(zhì)比例和濃度,有利于菌體的生長和代謝產(chǎn)物的積累。優(yōu)化后的發(fā)酵條件,如種齡、接種量和裝液量,有利于氧氣的傳遞和菌體的代謝活動(dòng),從而提高了丙酮酸的積累量。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究通過定向改造釀酒酵母,敲除PDC基因,并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,顯著提高了丙酮酸的積累量。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題,還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。釀酒酵母作為一種的安全菌,在食品工業(yè)和酒精生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用,因此,改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應(yīng)用前景。此外,本研究中的基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化策略也可以為其他微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供借鑒。

丙酮酸作為一種重要的有機(jī)酸,在化工、農(nóng)藥、農(nóng)用化學(xué)品及生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸將成為未來的主要趨勢。本研究通過定向改造釀酒酵母,提高了丙酮酸的積累量,為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略,具有重要的理論和實(shí)踐意義。

結(jié)論

本研究通過定向改造釀酒酵母,敲除PDC基因,并通過發(fā)酵條件優(yōu)化,顯著提高了丙酮酸的積累量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題,還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應(yīng)用前景,為丙酮酸的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了新的策略。本研究為其他微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了借鑒,具有重要的理論和實(shí)踐意義。

通過上述研究,我們不僅提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量,還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略。未來,我們將繼續(xù)深入研究釀酒酵母的代謝調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件,提高丙酮酸的產(chǎn)量和質(zhì)量,為丙酮酸的應(yīng)用提供更廣闊的空間。


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