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一、引言

二、納米線電極細胞電轉(zhuǎn)染裝置的設(shè)計與構(gòu)建

1. 納米線電極的制備

• 首先，選擇合適的基底材料，如硅片或玻璃片，對其進行嚴格的清洗和預(yù)處理，以確保表面的平整度和潔凈度。采用化學(xué)氣相沉積（CVD）技術(shù)或電化學(xué)沉積技術(shù)在基底上生長納米線。以制備硅納米線為例，在化學(xué)氣相沉積過程中，利用硅源氣體（如硅烷）在高溫和催化劑的作用下分解并在基底表面沉積形成硅納米線。通過精確控制反應(yīng)溫度、氣體流量、反應(yīng)時間等參數(shù)，可以調(diào)控納米線的直徑、長度和密度。

• 對生長好的納米線進行后處理，包括清洗去除雜質(zhì)、表面修飾等步驟。表面修飾可以采用生物相容性良好的材料，如聚乙二醇（PEG）等，以減少納米線對細胞的毒性并提高其與細胞的相互作用。

2. 電轉(zhuǎn)染裝置的構(gòu)建

• 將制備好的納米線電極集成到一個特制的電轉(zhuǎn)染腔室中。腔室的設(shè)計要考慮細胞懸液的容納量、電極間距的可調(diào)節(jié)性以及與外部電源的連接方式。采用微加工技術(shù)制作腔室的外殼，確保其密封性和生物相容性。

• 在腔室內(nèi)設(shè)置進樣口和出樣口，以便于細胞懸液的注入和取出。同時，安裝溫度控制系統(tǒng)和監(jiān)測裝置，保證轉(zhuǎn)染過程在適宜的溫度條件下進行，并且能夠?qū)崟r監(jiān)測腔室內(nèi)的物理參數(shù)（如電場強度、電流等）。

三、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng)與準備

• 選用常見的細胞系，如 HeLa 細胞或 293T 細胞，在適宜的培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）中進行培養(yǎng)。將細胞置于 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

• 轉(zhuǎn)染前，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞兩次，然后將細胞重懸于電轉(zhuǎn)染緩沖液（如 Opti - MEM 培養(yǎng)基，添加適量的葡萄糖和電解質(zhì)）中，調(diào)整細胞濃度至合適范圍（如 1×10? - 5×10? cells/mL）。

2. 轉(zhuǎn)染實驗操作

• 將含有外源核酸（如綠色熒光蛋白基因表達質(zhì)粒）的溶液與細胞懸液按照一定比例混合均勻。將混合后的細胞懸液緩慢注入到納米線電極電轉(zhuǎn)染裝置的腔室內(nèi)，確保細胞均勻分布在納米線電極周圍。

• 連接外部電源，設(shè)置不同的電壓參數(shù)（如 5 - 20 V）、脈沖寬度（如 10 - 50 ms）和脈沖次數(shù)（如 1 - 5 次）等。在電轉(zhuǎn)染過程中，利用監(jiān)測裝置記錄電場強度、電流變化等數(shù)據(jù)。

• 電轉(zhuǎn)染完成后，將細胞懸液在腔室內(nèi)靜置 5 - 10 分鐘，然后緩慢取出，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，加入新鮮的完整培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

3. 檢測與分析

• 在轉(zhuǎn)染后不同時間點（如 24、48、72 小時），利用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達情況，以評估轉(zhuǎn)染效率。通過計算表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例來確定轉(zhuǎn)染效率。

• 采用細胞計數(shù)試劑盒（如臺盼藍拒染法）檢測細胞的存活率。將轉(zhuǎn)染后的細胞與臺盼藍溶液混合，在顯微鏡下觀察未被染成藍色的活細胞數(shù)量，計算細胞存活率。同時，利用流式細胞術(shù)對細胞的凋亡情況進行分析，進一步了解電轉(zhuǎn)染過程對細胞的影響。

四、結(jié)果與討論

1. 轉(zhuǎn)染效率的影響因素

• 電壓參數(shù)對轉(zhuǎn)染效率有著顯著的影響。隨著電壓的升高，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在較低電壓下，電場強度不足，難以促使外源核酸有效地進入細胞內(nèi)；而當(dāng)電壓過高時，會對細胞造成嚴重的損傷，導(dǎo)致細胞死亡或功能喪失，從而降低轉(zhuǎn)染效率。例如，在 10 - 15 V 的電壓范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率相對較高，可達到 30% - 50%。

• 脈沖寬度和脈沖次數(shù)也與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)。適當(dāng)增加脈沖寬度和脈沖次數(shù)能夠提高轉(zhuǎn)染效率，但同樣需要注意避免過度的電刺激對細胞造成損傷。當(dāng)脈沖寬度為 20 - 30 ms、脈沖次數(shù)為 2 - 3 次時，在一定電壓條件下可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

2. 細胞存活率的變化

• 與傳統(tǒng)電穿孔法相比，納米線電極細胞電轉(zhuǎn)染裝置在相同轉(zhuǎn)染效率的情況下，能夠顯著提高細胞的存活率。這是由于納米線電極能夠在較低的電壓下產(chǎn)生局部增強的電場，減少了對整個細胞群體的電場沖擊。例如，傳統(tǒng)電穿孔法在轉(zhuǎn)染效率達到 30% 左右時，細胞存活率可能僅為 50% - 60%，而本研究中的納米線電極裝置在轉(zhuǎn)染效率為 30% - 50% 時，細胞存活率可維持在 70% - 80%。

• 細胞存活率還與納米線的表面修飾材料有關(guān)。采用生物相容性良好的聚乙二醇修飾的納米線電極能夠進一步提高細胞的存活率，減少細胞與納米線之間的非特異性相互作用和潛在的毒性反應(yīng)。

3. 裝置的應(yīng)用前景

• 本納米線電極細胞電轉(zhuǎn)染裝置在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，在癌癥基因治療中，可以將治療性基因（如抑癌基因）高效地導(dǎo)入腫瘤細胞內(nèi)，實現(xiàn)對腫瘤細胞的基因調(diào)控，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

• 在細胞工程方面，能夠用于細胞的基因編輯和改造，如誘導(dǎo)多能干細胞（iPS 細胞）的制備。通過精確控制轉(zhuǎn)染過程，可以將特定的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)塍w細胞內(nèi)，使其重編程為 iPS 細胞，為再生醫(yī)學(xué)和疾病模型的建立提供有力的工具。

五、結(jié)論