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一、引言

二、材料與方法

（一）材料

1. 細(xì)胞
   人肝細(xì)胞系（如 HepG2 細(xì)胞），培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 載體
   構(gòu)建好的核糖體打靶載體，帶有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因，用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。

3. 電轉(zhuǎn)染設(shè)備
   電轉(zhuǎn)儀（型號 [具體型號]），配備不同規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯。

4. 其他試劑
   電轉(zhuǎn)染緩沖液（如 Opti - MEM）、胰蛋白酶、臺盼藍(lán)等。

（二）實驗方法

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備
   （1）將 HepG2 細(xì)胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中，設(shè)置不同的初始細(xì)胞密度（如 1×10?、2×10?、5×10?個 / 皿），培養(yǎng)至不同的匯合度（如 50%、70%、90%）。
   （2）用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用 PBS 洗滌兩次，然后重懸于不同的電轉(zhuǎn)染緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍（如 1×10? - 1×10?個 /mL）。

2. 電轉(zhuǎn)染參數(shù)設(shè)置
   （1）設(shè)置不同的電壓值（如 100V、200V、300V）、脈沖時間（如 5ms、10ms、20ms）和脈沖次數(shù)（如 1 次、2 次、3 次），采用不同規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯（如 0.2cm、0.4cm 電轉(zhuǎn)杯）。
   （2）將重懸后的細(xì)胞與核糖體打靶載體混合（載體用量根據(jù)前期預(yù)實驗確定），加入電轉(zhuǎn)杯中，按照設(shè)定的電轉(zhuǎn)染參數(shù)進行電轉(zhuǎn)染。

3. 轉(zhuǎn)染后處理
   電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的完整培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時）觀察細(xì)胞狀態(tài)，并用熒光顯微鏡檢測 GFP 陽性細(xì)胞比例以評估轉(zhuǎn)染效率，同時采用臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞存活率。

三、結(jié)果

（一）細(xì)胞密度和匯合度對轉(zhuǎn)染效率和存活率的影響

（二）電轉(zhuǎn)染參數(shù)的影響

1. 電壓
   在電壓為 200V 時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到峰值，而過高的電壓（如 300V）會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，轉(zhuǎn)染效率反而降低。這表明合適的電壓對于維持細(xì)胞完整性和促進載體進入細(xì)胞至關(guān)重要。

2. 脈沖時間和脈沖次數(shù)
   脈沖時間為 10ms、脈沖次數(shù)為 2 次時，轉(zhuǎn)染效果較好。較短的脈沖時間可能無法使載體充分進入細(xì)胞，而過長的脈沖時間或過多的脈沖次數(shù)會對細(xì)胞造成不可逆的損傷。

3. 電轉(zhuǎn)杯規(guī)格
   0.2cm 電轉(zhuǎn)杯在本實驗條件下表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)染效率，可能是由于其更適合小體積的細(xì)胞 - 載體混合液，能夠更均勻地分布電場。

（三）緩沖液和溫度的影響

1. 緩沖液
   Opti - MEM 緩沖液相比其他常用緩沖液，能顯著提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。其特殊的成分可能有助于維持細(xì)胞在電轉(zhuǎn)染過程中的生理狀態(tài)。

2. 溫度
   在電轉(zhuǎn)染過程中，保持電轉(zhuǎn)杯和細(xì)胞 - 載體混合液在室溫（25°C）時的轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于在低溫（4°C）或高溫（37°C）條件下。室溫可能有利于電場與細(xì)胞的相互作用，減少溫度對細(xì)胞的應(yīng)激損傷。

四、討論

（一）細(xì)胞狀態(tài)的重要性

（二）電轉(zhuǎn)染參數(shù)的優(yōu)化機制

1. 電壓與細(xì)胞膜通透性
   電壓是影響電轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵參數(shù)之一。合適的電壓能夠使細(xì)胞膜暫時形成可逆性的小孔，允許載體進入細(xì)胞。當(dāng)電壓過高時，細(xì)胞膜會受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和內(nèi)容物泄漏，從而降低轉(zhuǎn)染效率。這種細(xì)胞膜通透性的改變是一個復(fù)雜的物理過程，與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和電場強度密切相關(guān)。

2. 脈沖時間和脈沖次數(shù)與載體進入細(xì)胞的效率
   脈沖時間和脈沖次數(shù)協(xié)同作用影響載體進入細(xì)胞的效率。適當(dāng)延長脈沖時間和增加脈沖次數(shù)可以增加載體進入細(xì)胞的機會，但過度的操作會對細(xì)胞造成累積性損傷。這可能是由于長時間或多次的脈沖會引起細(xì)胞膜的過度穿孔和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的紊亂，影響細(xì)胞的正常代謝和功能。

3. 電轉(zhuǎn)杯規(guī)格與電場分布
   電轉(zhuǎn)杯的規(guī)格影響電場在細(xì)胞 - 載體混合液中的分布。較小規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯能夠產(chǎn)生更均勻、更強的電場，使每個細(xì)胞受到更一致的電刺激，有利于載體均勻地進入細(xì)胞。而較大規(guī)格的電轉(zhuǎn)杯可能導(dǎo)致電場分布不均勻，部分細(xì)胞受到過高或過低的電場強度，影響轉(zhuǎn)染效率。

（三）緩沖液和溫度對轉(zhuǎn)染的影響

1. 緩沖液成分與細(xì)胞保護
   Opti - MEM 緩沖液中的成分可能對細(xì)胞在電轉(zhuǎn)染過程中起到保護作用。它可能含有一些能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度的物質(zhì)，減少電轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的損傷。此外，緩沖液的滲透壓等物理性質(zhì)也會影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，進而影響轉(zhuǎn)染效率。

2. 溫度與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)
   溫度在電轉(zhuǎn)染過程中對細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)有顯著影響。室溫條件下，細(xì)胞的生理活性和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性處于一個相對平衡的狀態(tài)，有利于電轉(zhuǎn)染的進行。低溫可能會使細(xì)胞膜變得僵硬，降低其對電場的響應(yīng)性，而高溫則可能加速細(xì)胞的代謝和應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞更容易受到電轉(zhuǎn)染損傷。

五、結(jié)論