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破解固定后染色難題的五大策略

閱讀:255      發(fā)布時(shí)間:2025-3-31
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一、抗原修復(fù)技術(shù)

原理:通過高溫(熱修復(fù))或蛋白酶K處理,破壞交聯(lián)鍵,暴露被封閉的抗原表位。

方法:

熱修復(fù):將切片浸入pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液,微波加熱至95℃維持15分鐘。

酶消化:使用0.05%-0.1%胰蛋白酶37℃處理10-30分鐘(適用于疏松組織)。

二、優(yōu)化固定條件

固定劑選擇:

固定劑

適用染色類型

缺點(diǎn)

4%多聚甲醛

常規(guī)免疫組化

強(qiáng)交聯(lián),需抗原修復(fù)

乙醇/丙酮

細(xì)胞涂片、冰凍切片

穿透力差,易致細(xì)胞收縮

鋅鹽固定液

磷酸化蛋白保留

成本高,保存期短

固定時(shí)間控制:

小塊組織(<5mm3)固定不超過24小時(shí),避免過度交聯(lián)。

三、穿透增強(qiáng)處理

去垢劑應(yīng)用:0.1%-0.3% Triton X-100處理10分鐘,增加細(xì)胞膜通透性。

凍融循環(huán):將組織反復(fù)凍融(-80℃?室溫),破壞致密結(jié)構(gòu)(慎用于脆弱樣本)。

四、封閉內(nèi)源性干擾物

內(nèi)源性過氧化物酶:3% H?O?室溫處理10分鐘。

自發(fā)熒光:0.1% Sudan Black B乙醇溶液浸泡10分鐘(適用于醛基固定樣本)。

五、試劑與染色方案適配

抗體驗(yàn)證:選擇經(jīng)固定組織驗(yàn)證的一抗(查閱文獻(xiàn)或說明書標(biāo)注“IHC/IF validated")。

染料適配:

核酸染料:優(yōu)先選用抗固定型染料(如DAPI替代Hoechst)。

熒光標(biāo)記:避免使用與自發(fā)熒光波長(zhǎng)重疊的探針(如Cy5替代FITC)。


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