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質(zhì)粒提取常見問題案例梳理,助您實(shí)驗(yàn)!

閱讀:493      發(fā)布時(shí)間:2025-1-15
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01

出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染


如圖所示,質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)明顯的RNA條帶,說明有RNA污染。

圖片


原因及解決方法:

(1)未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法:補(bǔ)加RNase A。

(2)加入RNase A的緩沖液 RS*長(zhǎng)期保存于室溫,導(dǎo)致RNase A活性下降。解決方法:每次使用后置于 4℃保存。若長(zhǎng)期不用,置于-20℃保存。

(3)細(xì)菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法:將細(xì)菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。


02

出現(xiàn)基因組污染

(1)菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法:溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。

(2)加裂解液 LB時(shí)操作時(shí)間過長(zhǎng),造成基因組DNA斷裂所致。解決方法:將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成

(3)細(xì)菌的質(zhì)量差(反復(fù)凍融的細(xì)菌,陳舊的細(xì)菌,培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等)中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA,使用生長(zhǎng)良好的新鮮細(xì)菌。


03

超螺旋質(zhì)粒比例低

如圖右所示,質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%,說明超螺旋比例低,一般超螺旋比例需要>90%,一般來說超螺旋比例越高,質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高,高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。


圖片


原因:裂解時(shí)間不宜過長(zhǎng),加入裂解液后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘,以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法:優(yōu)化裂解時(shí)間;確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行,減少離心力對(duì)質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響,因?yàn)檫^度的離心可能會(huì)破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。


04

內(nèi)毒素殘留高

圖片


常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中,質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離,在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中,內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu),其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似,常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會(huì)降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?,?duì)質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同,尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因沉默研究、基因治療等過程中,對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻,對(duì)于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),要求內(nèi)毒素殘留0.1~2.5 EU/ug,對(duì)于敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),要求內(nèi)毒素殘留<0.1 EU/ug。


原因:內(nèi)毒素去除時(shí)操作不當(dāng)或者未選擇合適的試劑

解決方法:

(1)如果采用的內(nèi)毒素清除的方法,離心之后,上層水相含DNA,下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時(shí)注意不要吸到藍(lán)色油狀層,里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

(2)在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時(shí),需要先活化樹脂,然后使用平衡緩沖液平衡樹脂,以確保最佳的去除效率。



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