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全蛋白的提取方法和注意事項

閱讀:904      發(fā)布時間:2024-10-25
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一、全蛋白的提取方法主要包括以下幾種?。

全蛋白的提取方法一:

  1. ?細胞準備和清洗?:首先,準備近乎長滿的細胞,例如10cm大皿中的細胞。使用預冷的PBS清洗細胞1-2次,并棄去PBS。

全蛋白的提取方法二:

  1. ?細胞裂解?:加入適量的裂解液,如RIPA裂解液(強),并加入PMSF以抑制蛋白酶活性。如果需要提取磷酸化蛋白,還需加入磷酸酶抑制劑。裂解液配好后,將細胞在4℃下裂解15分鐘。

全蛋白的提取方法三:

       超聲破碎?:將裂解后的細胞用超聲波破碎儀處理1-2分鐘,功率保持在20-30%,保持4℃。

全蛋白的提取方法四:

       離心?:超聲破碎后,將樣品在4℃、12000rpm下離心15分鐘。

全蛋白的提取方法五:

  1. ?蛋白變性?:吸取上清液至新的EP管中,加入適量的5x loading buffer,金屬浴100℃加熱10分鐘使蛋白變性。

全蛋白的提取方法六:

  1. ?存放?:將變性后的蛋白存至-80℃冰箱?。

  2. image.png

?二、全蛋白提取的注意事項包括?:

  1. ?細胞狀態(tài)和數(shù)量?:確保細胞處于良好的生長狀態(tài),并在收集后盡快進行裂解,以避免蛋白質(zhì)的降解和損失。

  2. ?裂解條件?:選擇合適的裂解方法,避免對蛋白質(zhì)的影響。注意控制溫度、pH值和離子濃度等因素,以確保蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和可溶性。

  3. ?離心條件?:離心時需提前開離心機預冷,確保在4℃下進行,以避免蛋白質(zhì)的變性。

  4. ?蛋白變性?:在加入loading buffer后,需充分加熱使蛋白變性,確保蛋白電泳時的穩(wěn)定性。

  5. ?存放條件?:將變性后的蛋白存放在-80℃冰箱中,以長期保存?。

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