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BCA法實驗原理、操作步驟

閱讀:1535      發(fā)布時間:2024-9-25
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一、實驗原理

BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法,測定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡合,并將其還原成Cu1+。Cu1+BCA試劑反應,使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍色復合物,在562 nm有強烈的光吸收,且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關系,因此可用于蛋白質(zhì)濃度測定。

?二、操作步驟

準備標準品和樣品?:將標準蛋白質(zhì)溶液(如牛血清白蛋白BSA)稀釋成一系列已知濃度的溶液,作為標準曲線。同時,將待測樣品適當稀釋,確保其在標準曲線的線性范圍內(nèi)。

配制BCA工作液?:根據(jù)標準品和樣品數(shù)量,按照50體積的試劑A1體積的試劑B的比例配制適量的BCA工作液。例如,如果測定4個樣品,每個樣品做3個復孔,則需要配制12200μL的工作液。

?加樣?:在96孔板的相應孔中加入20μL的標準品或待測樣品,然后加入PBS或其他緩沖液至總體積為20μL。

?加入BCA工作液?:向每個孔中加入200μLBCA工作液,輕輕混勻。

孵育?:將酶標板放在37℃孵育30分鐘,或者室溫下孵育2小時,使反應wanquan。

測定吸光度?:使用酶標儀在562nm波長下測定各孔的吸光度。

繪制標準曲線并計算樣品濃度?:將標準品的吸光度和對應的濃度繪制成標準曲線。然后,將待測樣品的吸光度代入標準曲線,計算出樣品的蛋白質(zhì)濃度。

BCA法實驗原理、操作步驟

三、注意事項

確保所有操作在無菌條件下進行,避免污染。

每次測定最好制作新的標準曲線,因為BCA反應可能會受溫度和時間的影響。

為保證結(jié)果的準確性,每個樣品應設置至少3個復孔,并取平均值進行計算。

注意試劑的保存條件和有效期,確保實驗的準確性。

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