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PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問題及原因分析

閱讀:1088      發(fā)布時(shí)間:2024-7-10
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  為了排除某些因素對(duì)PCR結(jié)果的影響,PCR實(shí)驗(yàn)需要對(duì)照實(shí)驗(yàn)。PCR的陽性對(duì)照是Marker,推測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度,判斷PCR產(chǎn)物是否是目的片段。PCR的陰性對(duì)照是PCR的空白管,除了模板不加之外,其成分與其他管一樣,證明沒有其他模板污染。下面讓我們一起來看看PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問題及原因分析吧!
 
  一、耗材選擇不當(dāng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大的影響
 
  PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質(zhì),因其為生物學(xué)惰性材料,表面不易于粘附生物分子,且有著良好的化學(xué)耐性,及溫度耐受性。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸,因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。
 
  PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上,優(yōu)先推薦選用低容管。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管有著較小的上方空間,可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí),需要避免加樣過量或過少。過量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降,溢出及交叉污染,而加樣過少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失。
 
  二、假陰性(無擴(kuò)增產(chǎn)物)——現(xiàn)象:陽性對(duì)照有條帶,而樣品則無
 
  原因:模板含有抑制物,含量低;緩沖液(Buffer)對(duì)樣品不合適;引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解;反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時(shí)間太短。
 
  對(duì)策:純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量;更換Buffer或調(diào)整濃度;重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu))或者換一管新引物;降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。
 
  三、非特異性擴(kuò)增——條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
 
  原因:引物的特異性不強(qiáng)、提取模板DNA中可能會(huì)有非靶基因性同源序列;模板或引物濃度過高;酶量過多;Mg2+濃度偏高;退火溫度偏低;循環(huán)次數(shù)過多。
 
  對(duì)策:重新設(shè)計(jì)引物;適當(dāng)降低模板或引物濃度;適當(dāng)減少酶量;降低鎂離子濃度;適當(dāng)提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補(bǔ)程度;減少循環(huán)次數(shù)。四、拖尾——產(chǎn)物在凝膠上呈模糊不清狀態(tài)(彌散)
 
  原因:模板不純;引物濃度不夠優(yōu)化;Buffer不合適;退火溫度偏低;酶量過多;dNTP、Mg2+濃度偏高;循環(huán)次數(shù)過多。
 
  對(duì)策:純化模板;對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋;更換Buffer;適當(dāng)提高退火溫度;適量用酶;適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度;減少循環(huán)次數(shù)。
 
  更多有關(guān)PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問題及原因分析,請(qǐng)聯(lián)系天津益元利康生物科技有限公司!

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