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Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)

閱讀:1380      發(fā)布時(shí)間:2024-3-5
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  Trizol是一種酸性試劑,能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA,其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細(xì)胞后,GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性,有利于保護(hù)RNA的完整性;加入氯仿離心后,樣品分為水相和有機(jī)相,RNA存在于上層水相中,而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中,從而達(dá)到分離的目的。簡(jiǎn)單來講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放,加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離,并進(jìn)一步純化得到RNA的過程。那么你知道Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)是什么嗎?讓我們一起來看看吧!
 
  1.樣品的制備
 
  1)細(xì)胞:按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞的比例加入Trizol試劑(注:一般來講待細(xì)胞在六孔板上生長至80%左右時(shí),每孔收集的細(xì)胞加1ml Trizol即可);
 
  2)組織:按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理,以利于RNA的釋放(注:組織可以先用液氮急凍后研磨處理,也可用勻漿器或者組織研磨器進(jìn)行處理,但要注意保持低溫,以防RNA降解);
 
  室溫裂解5-10min。
 
  2.氯仿抽提
 
  每1ml Trizol中加入200ul的氯仿,蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右,室溫孵育2-3min。2-8℃,12000g離心15min后溶液分為三層,從上到下依次為水相(RNA)、中間層及有機(jī)相(DNA、蛋白質(zhì)等),轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注:此步一定要小心謹(jǐn)慎,慢慢吸取,不可觸及中間層,以免RNA被污染)。
 
  3.異丙醇沉淀
 
  每1ml Trizol中加入500ul異丙醇,上下顛倒混勻后,室溫孵育10min,2-8℃,12000g離心10min,得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注:異丙醇最好提前預(yù)冷,維持低溫環(huán)境,以防RNA被降解)。
 
  4.乙醇洗滌
 
  棄去上清,加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀,2-8℃,7500g離心5min(注:75%乙醇可以用無水乙醇及無酶水來配制,同樣最好預(yù)冷處理;清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔,過于劇烈會(huì)導(dǎo)致RNA沉淀散開,再次離心未免會(huì)重聚,從而造成RNA的損失)。
 
  5.溶解
 
  棄去上清,于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min,用50ul左右的無酶水重懸沉淀,即可得到RNA溶液(注:干燥時(shí)間不可過長,太過干燥會(huì)導(dǎo)致沉淀很難溶解,部分溶解的RNA的260/280的比值會(huì)大大降低,甚至低于1.6;亦可采用金屬浴60℃,5min以助溶)。
 
  6.RNA質(zhì)量的檢測(cè)
 
  1)微量分光光度計(jì)
 
  純RNA的260/280比值在2.0左右,若比值偏小,則代表可能有蛋白或有機(jī)溶劑的污染,比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
 
  2)瓊脂糖凝膠電泳
 
  可見三條帶,從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA,一般情況下5s的帶非常淡,甚至看不清,28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍,且不存在拖尾,即可證明RNA純度可以,如若5s很明顯,而28s 與18s帶的亮度并無太大差別,甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。
 
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