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影響WB實(shí)驗(yàn)的因素有什么?

閱讀:1169      發(fā)布時(shí)間:2023-10-30
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WB實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中最為常見的實(shí)驗(yàn),那么你知道影響WB實(shí)驗(yàn)的因素有什么嗎?讓我們一起來看看吧!

一、蛋白樣本制備

1. 蛋白質(zhì)的樣品制備注意以下問題:

1)在合適的條件下,保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

2)選擇合適的表面活性劑和還原劑,使其形成各自多肽的溶液。

3)盡量去除核酸,多糖,脂類等分子的干擾,裂解完畢離心之后取中層澄清溶液時(shí)避免吸到底層沉淀和上層脂類。

4)整個(gè)制作蛋白樣本的制備過程必須在低溫下進(jìn)行,避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶類,但是注意不要反復(fù)凍融。

5)所抽取樣品的蛋白含量,蛋白變性是否充分等等,還有,蛋白樣品的pH值是否在7~8之間。這會(huì)直接影響到樣品濃縮的效果。此外,蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì)對(duì)最終結(jié)果的可靠性有影響。

2. 小分子量蛋白10KD需要的注意點(diǎn)

1)可選擇孔徑0.22μmPVDF膜或者NC膜,轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系;

2)也可以選擇PSQ膜,同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉(zhuǎn)移,其他按步驟即可。

3. 大分子量蛋白200KD需要的注意點(diǎn):

1)做200kd蛋白的WB時(shí)要注意,分離膠最好選擇>7%的;剝膠時(shí)要小心;

2)轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長;要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析);

3)轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低,推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高。

二、凝膠的配制

制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間,分離膠聚合控制在從加入10%APTEMED至開始凝膠,時(shí)間為1020分鐘(未wan全凝聚),濃縮膠最佳聚合時(shí)間為8-10min,可通過控制APTEMED量來控制。

1. 凝膠質(zhì)量

不連續(xù)SDS-PAGE膠對(duì)凝膠的要求較高,分離膠的pH值應(yīng)在8.8左右,而濃縮膠的pH應(yīng)在6.8左右,最好不要差過0.5個(gè)pH單位,因?yàn)檫@個(gè)pH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件,也是保證能充分壓縮樣品的前提。

因此,制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的pH值是否穩(wěn)定是很重要的。

2. 在用ddH2O壓分離膠的時(shí)候?yàn)槭裁唇?jīng)常存在中間凸的現(xiàn)象?

1)加水時(shí)不能對(duì)著膠沖,要沿著玻璃板緩慢流行;

2)加水滿后一定要保證上方水平面是平齊的;

3)加膠要避免氣泡,也要避免加膠太慢而提前凝固等現(xiàn)象;

三、電泳

1. 應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳,或者催化劑加入后充分混勻,否則條帶容易中間凹陷兩邊翹起。

2. 兩板玻璃之間排除所有的氣泡,防止條帶中間鼓兩邊下陷。

3. 加樣前離心,選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液(盡量用新鮮配制的,這樣能保證pH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定),加適量的樣品促溶劑,防止wb條帶拖尾或蛋白出現(xiàn)紋理。

4. 常用濃縮時(shí)80V,分離時(shí)100V比較好,條帶很平。

更多有關(guān)WB實(shí)驗(yàn)的影響因素,請(qǐng)聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。


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