免疫熒光染色技術(shù)是一種以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)和顯微技術(shù)發(fā)展而來(lái)的蛋白等分子檢測(cè)技術(shù)。那么你知道影響免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
一、免疫熒光染色方法的選擇
免疫熒光染色技術(shù)分為直接法和間接法。
直接法：將熒光標(biāo)記物偶聯(lián)在抗原/抗體上，直接與相應(yīng)的抗體/抗原反應(yīng)。
間接法：先用未標(biāo)記的一抗與抗原充分反應(yīng)后，再利用熒光標(biāo)記的二抗與已經(jīng)結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合，達(dá)到檢測(cè)抗原的目的。
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | |
直接法 | 操作簡(jiǎn)單、特異性高，非特異性染色少便于相同宿主來(lái)源的不同蛋白的共定位 | 靈敏性相對(duì)比間接法低 |
間接法 | 靈敏度高，染色更加靈活，成本低。 | 相對(duì)直接法操作復(fù)雜 |
二、抗體的選擇
與目標(biāo)蛋白直接結(jié)合的一抗，在條件允許的條件下，盡量選擇相同來(lái)源的免疫原或者選擇已驗(yàn)證種屬反應(yīng)性的抗體。
如果進(jìn)行不同目標(biāo)蛋白的雙染或多染時(shí)，這些不同蛋白所對(duì)應(yīng)的一抗應(yīng)該來(lái)源于不同宿主。
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | |
單克隆抗體 | 特異性高 | 靈敏度相對(duì)較低，制備過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格也相對(duì)較高 |
多克隆抗體 | 制備過(guò)程簡(jiǎn)單，周期短，價(jià)格相對(duì)較低，靈敏度更高，對(duì)于表達(dá)量較低的目標(biāo)蛋白更容易檢出。 | 特異性相對(duì)較低 |
單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應(yīng)性和抗體的宿主來(lái)源是抗體選擇最主要考慮的因素，其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯(lián)的二抗應(yīng)選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的抗體，及抗一抗的二抗。
三、抗體保存
防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。
在抗體保存過(guò)程中，適量分裝，避免反復(fù)凍融。
蛋白極易被塑料等吸附，如果用塑料管分裝，抗體中應(yīng)添加BSA等。
為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的die氮化鈉。
為防止淬滅，保存熒光抗體時(shí)應(yīng)該注意避光，可以利用錫箔紙包好，或者放在避光的容器中。
四、培養(yǎng)載體的選擇
根據(jù)貼壁情況，細(xì)胞可分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞一般常用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，接種細(xì)胞前放置0.17mm玻璃細(xì)胞爬片。
懸浮細(xì)胞常用6孔板培養(yǎng)，免疫熒光染色處理后，取少量加在0.17mm玻璃細(xì)胞爬片上。
最后將細(xì)胞爬片倒扣到載玻片上，封片，放4℃保存。
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