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熒光定量PCR的原理是什么?

閱讀:964      發(fā)布時(shí)間:2023-9-12
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熒光定量PCRReal-time PCR),是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。那么你知道熒光定量PCR的原理是什么嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

以探針?lè)晒舛?/span>PCR為例:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。開(kāi)始時(shí),探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,檢測(cè)不到熒光信號(hào);PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完quan同步。

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傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離,并且只能作定性分析,不能準(zhǔn)確定量,易造成污染出現(xiàn)假陽(yáng)性,使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量,且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動(dòng)化程度高和無(wú)污染的特點(diǎn),使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR

PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里,熒光信號(hào)變化不大,接近一條直線(xiàn),這樣的直線(xiàn)即是基線(xiàn),這條線(xiàn)是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,這個(gè)期間擴(kuò)增曲線(xiàn)具有高度重復(fù)性,在該期間,可設(shè)定一條熒光閾值線(xiàn),它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值,這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系,且該值具有重現(xiàn)性。

 

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Ct值最大的意義就是用來(lái)計(jì)算目的基因的表達(dá)量,此時(shí)就有兩個(gè)概念容易被提及,那就是絕對(duì)定量和相對(duì)定量,絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目,即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例,而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。

Ct值誠(chéng)然可以被利用來(lái)計(jì)算這兩種定量結(jié)果,但是絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品,必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取,實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對(duì)定量的方法來(lái)計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

 

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