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細胞樣品 RNA 的提取

閱讀:979      發(fā)布時間:2023-07-12
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簡介

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獲得高質(zhì)量和完整的 RNA 是很多分子生物學(xué)實驗中最重要的一步,當(dāng)前應(yīng)用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

原理

1、4℃ 預(yù)冷離心機;

2、取出培養(yǎng)皿,在超凈臺中去除培養(yǎng)基,按照每 1x10細胞加入 1mL Trizol 試劑,用槍頭吹打充分裂解細胞;

3、將細胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 無 RNA 酶的 EP 管中,向每個 EP 管中加入(1/5 Trizol 體積的)200 μL 氯仿,上下翻轉(zhuǎn)充分混合后,室溫靜置 10 分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物wan解離;

4、在 4℃ 下 12000 g 離心 15 分鐘;

5、離心后,將上層水相(約 1/2 Trizol體積)小心轉(zhuǎn)移到一個新的 EP 管,加入等體積異丙醇,震蕩后室溫靜置 5-10 分鐘,然后 12000 g 4℃ 離心 15 分鐘,棄上清保留沉淀;

6、加入1 mL 75% 乙醇清洗并沉淀 RNA,12000 g 離心 10 分鐘;

7、棄上清,并重復(fù)上述操作一次;

8、棄上清,在超凈工作臺中打開 EP 管蓋,風(fēng)干 5-10 分鐘,不需wan干燥;

9、視沉淀的量,加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 雙蒸水中;

10、待沉淀溶解后,用 nanodrop 測定其濃度和純度并作標(biāo)記,進行下游實驗,多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

用途

RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA 體外轉(zhuǎn)錄與翻譯等。

材料與儀器

【材料】:細胞;Trizol 試劑;氯仿;異丙醇;75% 乙醇(使用 RNase-Free 水配制);RNase-Free 水。

【物品及儀器】:1.5 ml EP管(RNA-free),大,中,小號槍頭(RNA-free),移液器,渦旋振蕩器,高速冷凍離心機,超凈工作臺。

步驟

1、4℃ 預(yù)冷離心機;

2、取出培養(yǎng)皿,在超凈臺中去除培養(yǎng)基,按照每 1x10細胞加入 1mL Trizol 試劑,用槍頭吹打充分裂解細胞;

3、將細胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 無 RNA 酶的 EP 管中,向每個 EP 管中加入(1/5 Trizol 體積的)200 μL 氯仿,上下翻轉(zhuǎn)充分混合后,室溫靜置 10 分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物wan解離;

4、在 4℃ 下 12000 g 離心 15 分鐘;

5、離心后,將上層水相(約 1/2 Trizol體積)小心轉(zhuǎn)移到一個新的 EP 管,加入等體積異丙醇,震蕩后室溫靜置 5-10 分鐘,然后 12000 g 4℃ 離心 15 分鐘,棄上清保留沉淀;

6、加入1 mL 75% 乙醇清洗并沉淀 RNA,12000 g 離心 10 分鐘;

7、棄上清,并重復(fù)上述操作一次;

8、棄上清,在超凈工作臺中打開 EP 管蓋,風(fēng)干 5-10 分鐘,不需wan干燥;

9、視沉淀的量,加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 雙蒸水中;

10、待沉淀溶解后,用 nanodrop 測定其濃度和純度并作標(biāo)記,進行下游實驗,多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

注意事項

1、過程中需佩戴口罩和新手套,對臺面以及周圍環(huán)境進行滅酶處理,盡量在超凈臺中進行操作;

2、使用無 Rnase 的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

3、溶液配制應(yīng)使用無 Rnase 的水,(將水加入到干凈的玻璃瓶中,加入 DEPC 至終濃度為 0.1%V/V),放置過夜,高壓滅菌。注:DEPC 有致癌之嫌,須小心操作)。

4、Trizol 裂解液非常危險,因小心避免濺到身上,臺面上的 Trizol 要及時清理干凈。

常見問題

RNA 得率過低:

1.使用更有效的破碎/勻漿方法。如液氮搗碎、酶消化破壁、電動勻漿器勻漿;

2.更換抽提試劑;

3.核酸濃度低時,采用低溫沉淀,并延長沉淀時間;

4.增加細胞。

RNA 質(zhì)量不高:

1、取上層水相時求多,吸到了下層有機相;

2、清洗不干凈。

天津益元利康生物科技有限公司提供Zymo RNA提取試劑盒,更多有關(guān)RNA提取實驗產(chǎn)品和資料,請聯(lián)系益元利康客服!

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