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細胞質(zhì) RNA 提取實驗

閱讀:773      發(fā)布時間:2023-07-07
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材料與儀器

RNA
PBS 細胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 異戊醇 無水乙醇
離心機 培養(yǎng)箱

步驟

1. 對于單層培奍細胞
1)每10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細胞,用冰冷PBS洗滌3次。
2)每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細胞,轉(zhuǎn)移至冰浴的離心管中。
3300 g 離心5 min,棄上清,繼續(xù)冰浴。

2. 對于懸浮培養(yǎng)細胞
1300 g 離心5 min,棄上請。
2)細胞以1/2原體積的冰冷重懸,再離心后棄上清。

3. 重懸細胞于375 μl 冰冷的細胞裂解緩沖液,并置冰浴5 min。
4. 4℃在微量離心機中離心2 min,將上清移至一個潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋渦混合器上振蕩。

5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K,37℃溫育15 min

6. 加入400 μl /氯仿/異戊醇抽提,在旋渦混合器上振蕩用微量離心機離心,上清移至干凈的離心管中,重復(fù)抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰,上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液(pH7.5),再加無水乙醇,混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min-20℃過夜。

9. 用微量離心機4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉(pH5.2)冼滌沉淀。
10. 干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中,測A280A260,其與的RNA可在-70℃貯存。

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